hxy-第四章-目的基因的獲取-文庫(kù)吧資料
2025-05-13 18:09本頁(yè)面
【正文】 6. cDNA文庫(kù)的大小 一個(gè) cDNA文庫(kù)要包含 99%的 mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ 5’ 3’ 在雙鏈 cDNA末端接上 人工接頭 ，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 DNA Pol I除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶 連成一整條 DNA鏈。 cDNA第一鏈 5’ cDNA第二鏈合成 DNA聚合酶 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ ③ cDNA第二鏈合成 這種酶能識(shí)別 mRNAcDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小 片斷 。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 ② 降解 mRNA模板 或 RNaseH 堿 方法一：剩下的 cDNA單鏈的 3’末端一般形成一個(gè) 彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu) （機(jī)理不明），可成為合成第二條 cDNA鏈的引物。 用 Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成 cDNA的第一鏈。 mRNA只占總 RNA的 1%2%。 分離 mRNA用商業(yè)化的 Oligo dT纖維柱。 （ 4）比 DNA文庫(kù)小 的多，容易構(gòu)建。 （ 2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。 2. cDNA library 二、 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 利用某種生物的 總 mRNA合成 cDNA，再將這些 cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱(chēng) cDNA文庫(kù)。 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 粘性末端 ③ 同聚物加尾 4. 基因組文庫(kù)的大小 一個(gè)文庫(kù)要包含 99%的基因組 DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。 ② 人工接頭法（ adaptor） 人工合成的限制性?xún)?nèi)切酶粘性末端片斷。 如： Sau3A與 BamHI的酶切末端?？傻玫?030kb的隨機(jī)片斷。 （ 1）染色體 DNA大片段的制備 3. 基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟 超聲波（ 300bp）或機(jī)械攪拌（ 8kb）。 （ 1）對(duì)載體的要求 ?載體系列： 容量為 24 kp cosmid載體： 容量為 50 kb YAC： 容量為 1 Mb BAC: 容量為 300 kb 斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接。 一、基因文庫(kù)的構(gòu)建 1. 基因文庫(kù)（ gene library） 第三節(jié) 目的基因的保存和擴(kuò)增 （ 2） 目前常用的載體 2. 構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用 載體能夠容載的 DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的 重組子 的數(shù)目。 EcoRI EcoRI Linker Adaptor 將某種生物細(xì)
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