hxy-第四章-目的基因的獲取-wenkub.com
2025-05-04 18:09 本頁面
【正文】 適合擴增真核生物基因。 選擇有差異的帶，進一步 PCR作探針。 RT NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ cDNA第二鏈，并 PCR （ 4）隨機引物與錨定引物成對擴增 12種錨定引物，若與 20種隨機引物，可組成 240組引物。 不能雜交的 cDNA就包括特異表達的 A基因的 cDNA單鏈。 特異mRNA 洗脫 RTPCR 2. mRNA消解雜交 原理： 羥基磷灰石柱 結(jié)合單鏈 DNARNA或 DNADNA雙鏈，不結(jié)合單鏈 DNA。 N= ln (1p) ln (1 ) p: 文庫包含了完整 mRNA的概率（ 99%） : 某一種低豐度（不足 14份拷貝） mRNA占細(xì)胞整個 mRNA的比例 N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)） 1 n 1 n 三、文庫的查詢（ screening） 用目的基因探針與文庫中的重組載體進行 Southern blot雜交。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二鏈 cDNA第一鏈 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 ④ 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 核酸酶 S1 用 核酸酶 S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致 cDNA中有用的序列被切掉！）。用 DNA聚合酶合成第二鏈 DNA.。 （ 2） mRNA的分離純化 ① 原理 ② mRNA的分離純化 Column（柱） 反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3） cDNA的合成 ① cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以 RNA為模板合成 DNA。 4. 構(gòu)建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1）總 RNA（ total RNA）提取 3. cDNA文庫的特點 提取總 RNA有商業(yè)化的試劑盒（ kit）。 （ 1） 不含內(nèi)含子序列 。 各種酶的接頭可以向公司定做或購買。 ② 酶切法： （ 2）載體與基因組 DNA大片段的連接 ① 粘性末端直接連接 載體與外源 DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的 全部基因 ，稱為基因文庫。 （ 2） 5’端磷酸化 （ 1）互補配對 （合成的 DNA單鏈的 5’端是 OH） T4 DNA連接酶 T4多核苷酸激酶 使 5’OH磷酸化 完整的 DNA雙鏈 （ 3） 連接酶連成完整雙鏈 2. 互補延伸連接法 預(yù)先設(shè)計的片斷之間有 局部互補區(qū) ，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用 DNA聚合酶 延伸成完整的雙鏈。 第二節(jié) 化學(xué)合成目的基因 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亞磷酸三酯法、 固相合成法 自動化合成法。
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