hxy-第四章-目的基因的獲取-資料下載頁
2025-05-07 18:09本頁面
【正文】 羥磷灰石柱 B A PCR 16 cDNA文庫 3. mRNA差異顯示 PCR（ DD RTPCR） mRNA differential display RTPCR （ 1） 3’端的錨定引物 Oligo(dT)引物的 3’端加兩個核苷酸（倒數第二個不再是 T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M： A、 G or C N: A、 G、 T or C 5’ 3’ （ 2） 12種錨定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’ 3’ （ 3） 5’端的隨即引物 10 mer AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT 5’ 3’ 擴增 cDNA第一鏈。 RT NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ NNNNNNNNNN 5’ 3’ cDNA第二鏈，并 PCR （ 4）隨機引物與錨定引物成對擴增 12種錨定引物，若與 20種隨機引物，可組成 240組引物。 引物組合： 240組能分出 20220多條帶！ 實驗結果： 如果每條帶相當于一種 mRNA， 20220 mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的 mRNA。 在測序膠上，每組擴出 50100條長度為 100500bp的帶。 （ 5）隨機 錨定引物 PCR的產物電泳比較 不同組織的 240組引物組合 PCR產物在測序膠中電泳。 選擇有差異的帶，進一步 PCR作探針。 篩選文庫，找到差別基因的全長序列。 二、 PCR擴增獲得目的基因 1. 直接從基因組中擴增 （ 1）提取基因組 DNA作模板 （ 2）根據目的基因序列設計引物 （ 3） PCR擴增 真核生物基因組含有內含子！ 適合擴增原核生物基因。 原核基因組部分 原核細胞 提取基因組 DNA PCR擴增 （ 1）提取基因組 total RNA （ 2）反轉錄合成總 cDNA作模板 （ 4） PCR擴增 （ 3）根據目的基因序列設計引物 2. 從 mRNA中擴增 : RTPCR 原核生物不易得到 mRNA，也不含有polyA尾。 適合擴增真核生物基因。 目的基因 的引物 1 反轉錄成目的基因 cDNA第一鏈 目的基因 的引物 2 目的 基因 cDNA第二鏈 PCR mRNA
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