目的基因的獲取ppt課件-資料下載頁
2025-01-15 05:38本頁面
【正文】 獲得目的基因。 一、染色體步移 二、染色體登陸 一、染色體步移 （ chromosome walking） 按照已知的分子標記基因制備探針，與文庫雜交得到陽性克隆，再用該陽性克隆內基因末端為探針，再與文庫雜交，如此重復，直到 350kb以后，得到的陽性克隆為目的基因。 已知的分子標記基因 350kb 未知的目的基因 ? 染色體步移的缺點 得不到重疊克隆而被打斷，前功盡棄 遇到重復序列而改變步移方向 二、染色體登陸（ chromosome landing） 構建插入片段平均長度大于目的基因與其緊密連鎖的分子標記之間的距離的基因文庫，可以通過篩庫直接獲得含有目的基因的大克隆，從中分離目的基因，稱為染色體登陸。 第六節(jié) mRNA差別顯示技術獲得差異表達的基因 ?mRNA差異顯示技術（ mRNA differetial display）：將 mRNA逆轉錄和 PCR技術結合起來的一種 RNA指紋圖譜技術，因此稱 DDRTPCR。是一種快速有效的克隆差異性表達基因的方法。 原理： 用 3 ’端錨定引物和反轉錄酶合成 cDNA的第一鏈；用 3 ’端錨定引物和 5’端 10mer隨機引物組成引物對，以反轉錄第一鏈為模板進行 PCR擴增（ DDRTPCR），在標準的序列膠中電泳 23小時，可顯示出 50100條長度在 100500bp之間的 DNA條帶。 3 ’錨定引物： 12種不同的引物，用以反轉錄 mRNA，合成第一鏈 cDNA。這種引物通常叫作 339。端錨定脫氧核苷酸引物，并用 539。T11MN或 539。T12MN通式表示。其中 M為除了 T以外的任何一種核苷酸（即 A、 G或 C），而 N則為任何一種核苷酸（即 A、 G、 C或 T），故 MN共有 12種不同的排列組合方式。 mRNA: 5’N‘M’AAAAAA… AA3’(12種序列 ) 3’NMTTTTTTT… TT5’ 5’隨機引物 ： 10mer，更好的同第一鏈結合，從而呈現(xiàn)出更多種的 mRNA。一般用 20種隨機引物和 12種 3’端錨定引物組成的全部 240組引物對 PCR擴增后，所產生的大約 20 000條條帶，涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細胞中所表達的 96%的 mRNA。 第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)分離目的基因 ?有效的分離能與已知的靶蛋白質相互作用的蛋白質的編碼基因。 ?應用于真核基因的表達調控，細胞粘合因子間的相互作用、信號轉導通路以及細胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究。 基本原理： 許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成（ example）； 應用重組 DNA技術，也可以將來自同一個轉錄因子的、或者兩種不同轉錄因子的、分開的兩種結構域，在體內重新組裝成具有功能的轉錄因子，從而激活 UAS（上游激活序列）下游啟動子調節(jié)的報告基因的表達。 Example: 釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉錄激活因子 GAL4，在 N端 1～ 147位氨基酸區(qū)段有一個結合域（ DNAbinding domain, DNABD ）；在 C端 768～ 881位氨基酸區(qū)段有一個轉錄激活域（ transcription activation domain,AD） DNA BD 能識別激活序列并與之結合； AD通過同轉錄機制中的其它成份之間的結合作用啟動下游基因進行轉錄。 用 DNA重組技術將它們分開，即使在同一個寄主中表達，也不會直接發(fā)生相互作用不能激活相關的效應基因進行轉錄。 獲取目的基因的選擇策略 ?已知目的基因的部分序列，或其他物種中同源基因的保守序列； ?已知基因表達的蛋白產物； ?已知與目的基因緊密連鎖的分子標記或有可操作的功能性轉座子； ?組織、細胞或誘導特異表達。 思考題： 試述構建基因文庫的原理和步驟 ?
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