【正文】 繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為 細(xì)胞系形成 ，此時的細(xì)胞成為 細(xì)胞系。 20221022 113 目的基因在宿主中的表達(dá) 高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件 高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件 ?細(xì)胞系特征： 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng) ?遺傳穩(wěn)定性： 外源基因多次傳代后不會丟失，易于長期保存 ?合適的標(biāo)記： 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持 ?生長快且齊： 分裂周期短，生長均一，便于控制 ?安全性能好： 不合成致病物質(zhì)，不致癌 大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。 20221022 114 目的基因在宿主中的表達(dá) 高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記 20221022 115 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 1）營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞 ?含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（ tk） 不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因 tk能與之遺傳互補(bǔ)。 不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因 hprt與之遺傳互補(bǔ)。 20221022 116 目的基因在宿主中的表達(dá) ?含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（ hprt） （ 2）哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記 遺傳標(biāo)記 APH DHFR HPH TK 編碼產(chǎn)物 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 二氫葉酸還原酶 潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 篩選藥物 G418 氨甲喋呤 潮霉素 B 氨基喋呤 作用機(jī)理 APH滅活 G418 DHFR變體抗氨甲喋呤 HPH滅活潮霉素 B TK合成 TMP XGPRT 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 XGPRT合成 GMP ADA 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA滅活 XylA 20221022 117 目的基因在宿主中的表達(dá) 常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞 迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要是 中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO），其優(yōu)勢有如下幾個方面： ?遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定 ?與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確 ?基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善 ?耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng) ?被美國 FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（ GRAS） 20221022 118 目的基因在宿主中的表達(dá) ?人腺病毒 DNA ?猴多瘤病毒 DNA（ SV40） ?人乳多瘤病毒 DNA（ BKV） ?人牛痘病毒 DNA 20221022 119 目的基因在宿主中的表達(dá) 人腺病毒 DNA （ 1）腺病毒的生物學(xué)特性 腺病毒科為線狀雙鏈 DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒有 6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是 C亞屬的 2型（ Ad2）和 5型（ Ad5）病毒。 腺病毒感染人細(xì)胞時 呈裂解型，不致癌 ；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。 20221022 120 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）腺病毒的基因組 DNA 腺病毒基因組 DNA全長 36 kb，其 包裝上限為原基因組的 105%。 DNA兩端各有 一個 反向重復(fù)序列（ ITR） ； E1E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的 表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中 E3編碼晚期基因的調(diào)控因子； L1L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期 基因； IVa VA均為病毒 RNA聚合酶的亞基編碼基因。 E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒 的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個 kb的片段， 使得載體的裝載量提高到 4 kb以上。 20221022 121 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）腺病毒 DNA載體的特點 ?基因重排低： 外源基因與病毒 DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期 ?安全性能好： 不整合人的染色體 DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤 ?宿主范圍廣： 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格 ?使用效果好： 外源基因在載體上容易高效表達(dá) 20221022 122 目的基因在宿主中的表達(dá) 猴多瘤病毒 DNA（ SV40） （ 1） SV40的生物學(xué)特性 ?SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP VP VP3三種 衣殼蛋白 包裝而成，基因組為 5224bp的雙鏈環(huán)狀 DNA。 ?SV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白 H H H4結(jié)合，從而使其 DNA形成類似 核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。 ?SV40感染猴細(xì)胞時 呈裂解型，不致癌 ；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。 20221022 123 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2） SV40的基因組 DNA ?t / T基因： 編碼病毒的小抗原和大抗原，與病毒的致癌作用密切相關(guān)。 ?高效表達(dá)外源蛋白： SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有 105個病毒 DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白。 20221022 124 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3） SV40 DNA質(zhì)粒 DNA雜合載體的構(gòu)建 重組的 SV40 DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的 外源 DNA片段不能太大。為了盡量提高 SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此 重組的 SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。 ?pV2GPT： 是一種 SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒 DNA雜合的載體，其中 gpt為細(xì)菌來源的谷氨酸 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。 該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔 β珠蛋白。 20221022 125 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 4）利用 SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序 20221022 126 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 5） SV40 DNA載體的特點 ?基因表達(dá)好： 外源基因能高效表達(dá) ?基因重排高： 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象 ?宿主范圍窄： 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞 ?裝載量較小 20221022 127 目的基因在宿主中的表達(dá) 人乳多瘤病毒 DNA（ BKV） （ 1）人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性 人乳多瘤病毒（ BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈 DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復(fù)制，每個宿主細(xì)胞最高可達(dá) 500個拷貝。 20221022 128 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成 穿梭載體 ，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。 安裝細(xì)胞色素 P450 dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子 DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子 MMTP，由其啟動外源基因的表達(dá)。 SV40來源的啟動子控制 Neor標(biāo)記基因，以 G418篩選重組子。 以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá) β1干擾素和單純皰疹病毒 B蛋白獲得成功。 20221022 129 目的基因在宿主中的表達(dá) 人牛痘病毒 DNA （ 1）人牛痘病毒的生物學(xué)特性 人牛痘病毒是一個大型 DNA病毒，基因組長 185 kb，能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建 出 的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的 病 毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外 D NA重組很困難，因此通常采用 體內(nèi)重組 的方式進(jìn)行。 20221022 130 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）人牛痘病毒 DNA表達(dá)載體的構(gòu)建 目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒。其基因組上插入了一個可表達(dá)的 大腸桿菌 T7RNA聚合酶編碼基因 。在外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá) T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和 T7啟動子 的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體 DNA上，并在 T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。 人囊狀纖維化基因就是采用這種策略高效表達(dá)的。 20221022 131 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序 20221022 132 目的基因在宿主中的表達(dá) ?哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法 ?哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法 20221022 133 目的基因在宿主中的表達(dá) 哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點是 外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列 ，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體 DNA上，易導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。 20221022 134 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 1）磷酸鈣共沉淀法 將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入 CaCl2溶液混勻，此時 DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)； 將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 37℃ 保溫 416小時此時 細(xì)胞膜形成吞噬泡 ，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞； 棄去 DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。 在外源 DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性 DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。 利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒 DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。 20221022 135 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 2）電擊轉(zhuǎn)化法 將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶解在受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀 的 樣品槽內(nèi)，兩端施加 瞬時高壓電場， 使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時 DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。 電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如 生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞 等。 20221022 136 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 3）脂質(zhì)體介導(dǎo)法 將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶解，與天然或人工合成的磷脂混合，后者在 表面 活性劑的存在下 形成包埋水相 DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，它便會與受體細(xì)胞膜融合， DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。 利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的 淋巴細(xì)胞 和HeLa細(xì)胞（ 子宮頸癌細(xì)胞 ） 。 20221022 137 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 4）顯微注射法 通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵； 借助于顯微鏡將純化的 DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內(nèi)。 上述程序 多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程 ，由于必須單細(xì)胞逐一操作，所以 不太適用于基因的克隆和表達(dá)。 20221022 138 目的基因在宿主中的表達(dá) （ 5）血影細(xì)胞介導(dǎo)法 血影細(xì)胞 是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時， 外源 DNA也容易進(jìn)入 。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此， 可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源 DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 20221022 139 目的基因在宿主中的表達(dá) 哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒 DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有 定向性好、實驗重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高 等優(yōu)點， 但 也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限， 往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家禽和牲畜細(xì)胞等。 20221022 140 目的基因在宿主中的表達(dá) ?哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 ?利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體 ?利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑 ?利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子 VIII 20221022 141 目的基因在宿主中的表達(dá) 哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 （ 1）通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。 氨甲喋呤（ MTX） 是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶（ DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞