【正文】 錨定引物 ， 它是由 11～ 12個(gè)連續(xù)的脫氧核 苷 酸加上兩個(gè) 3’端錨定脫氧核 苷 酸組成 ， 并用 5’T11MN或 5’T12MN通式表示(其中 M為除了 T以外的任何一種核 苷 酸 , 而 N則為任何一種核 苷 酸 ，故 MN共有 12種不同的排列組合方式 ) 。這樣 ， 每一種此類(lèi)人工合成的寡核 苷 酸引物 ， 都將能夠把總 mRNA群體的 1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNAcDNA雜交分子。 5’ T T T T T T T T T T M N 3’ 1212 種錨定引物種錨定引物AG TTT TTT TT 5 ’3 ’CG TTT TTT TT 5 ’3 ’GG TTT TTT TT 5 ’3 ’TG TTT TTT TT 5 ’3 ’AA TTT TTT TT 5 ’3 ’CA TTT TTT TT 5 ’3 ’GA TTT TTT TT 5 ’3 ’TA TTT TTT TT 5 ’3 ’AC TTT TTT TT 5 ’3 ’CC TTT TTT TT 5 ’3 ’GC TTT TTT TT 5 ’3 ’TC TTT TTT TT 5 ’3 ’種錨定引物種錨定引物種錨定引物種錨定引物2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 100 ? 以 mRNA:cDNA為模板， 以一種由 10個(gè)核 苷 酸組成的 5‘端 隨機(jī)引物 (20種 )和 3’端 錨定引物 (12種 )組成的全部 240組引物對(duì)作 PCR擴(kuò)增 ,可 以獲得 20220條左右的 DNA條帶 ， 其中每一條都代表一種特定的 mRNA種類(lèi)。這個(gè)數(shù)字大體上涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類(lèi)型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的 mRNA種類(lèi)。 55 ’’ 端的隨即引物端的隨即引物cDNA10 m erA A A A A A A A A A A A A A A Am R NA 3 ’5 ’NM TTT TTT TT5 ’3 ’擴(kuò)增 cDNA 第一鏈。RTNM TTT TTT TT 5 ’3 ’N N N N N N N N N N5 ’ 3 ’N N N N N N N N N N5 ’3 ’cDNA 第二鏈，并 PCR第一鏈。第一鏈。2022/2/12 101 ? 在 PCR反應(yīng)中加入放射性核素 35S或 32p標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)后 ,進(jìn)行 變性聚丙烯 酰胺 膠凝膠電泳 ，經(jīng)放射性自顯影在同一膠板上進(jìn)行不同樣品間比較 ， 找 出差異表達(dá)條帶 并 回收差異條帶 ， 利用該片段制備探針進(jìn)行 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的篩選 ，以分離該差異片段對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng) cDNA或完整基因。 2022/2/12 102 隨機(jī) 錨定引物 PCR的產(chǎn)物電泳比較 不同組織的 240組引物組合 PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。 選擇有差異的帶，進(jìn)一步 PCR作探針。 篩選文庫(kù)，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 103 過(guò)程總結(jié)圖 對(duì)照系組織細(xì)胞 總 RNA 被誘導(dǎo)細(xì)胞 差異條帶回收，克隆入載體 與 3‘引物和 5’引物進(jìn)行 PCR 總 RNA 以 5’T11MN為引物反轉(zhuǎn)錄 mRNA:cDNA雜合子 PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 放射自顯影 Northern雜交鑒定差異條帶的真實(shí)性 差異條帶的序列分析 從基因組文庫(kù)或 cDNA文庫(kù)中獲得cDNA全長(zhǎng)或基因全長(zhǎng) 進(jìn)行基因功能鑒定 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 104 代表性差別分析 (representation difference analysis, RDA) ? 代表性差別分析技術(shù)的 基本原理或核心內(nèi)容 是 ：充分發(fā)揮了 PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板 ， 以線(xiàn)性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性 ， 通過(guò)降低 cDNA群體的復(fù)雜度和多次更換 cDNA兩端接頭引物等方法 ，達(dá)到克隆基因的目的。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 105 代表性差別分析技術(shù) 流程 ? 代表性差別分析是通過(guò)突變型 (驅(qū)趕 DNA,driver DNA,DDNA)與野生型 (檢測(cè) DNA,tester DNA,TDNA)基因組之間的差異比較來(lái)分離和鑒定突變基因的方法。如以野生型基因組 DNA為檢測(cè) DNA,而突變型 DNA為驅(qū)趕 DNA,可獲得缺失序列 ； 相反以突變型 DNA為檢測(cè) DNA,野生型 DNA為驅(qū)趕 DNA,可獲得 重排和擴(kuò)增的基因。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 106 ①檢測(cè) DNA和驅(qū)趕 DNA的制備 ? 正常 與 突變基因組 DNA經(jīng)能限制性核酸內(nèi)切酶作用后 ，再連上含有該酶酶切位點(diǎn)的寡核 苷 酸接頭 R24～ R12，以R24為引物 PCR擴(kuò)增后 ， 正常 組 用同一內(nèi)切酶切下接頭再連上另一組含有該酶酶切位點(diǎn)的接頭 J24～ J12并 以 J24為引物 PCR擴(kuò)增制成 檢測(cè) DNA（ TDNA)； 突變基因組不再連上另一組接頭制成 驅(qū)趕 DNA(DDNA)。這樣檢測(cè) DNA和驅(qū)趕 DNA代表了基因組 DNA的一部分 ， 且由一系列小片段DNA組成 ， 降低了基因組 DNA的復(fù)雜度 ， 使下步雜交快速和有效 。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 107 ② 液相雜交 ? 檢測(cè) DNA和驅(qū)趕 DNA按一定的比例 (1:100～ 200)， 在適當(dāng)?shù)木彌_體系中高溫變性 ， 中溫 (67℃ )長(zhǎng)時(shí)間復(fù)性 (20h)后 ， 90%的單鏈 DNA都復(fù)性成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu) ， 出現(xiàn)四種情況的組合 DNA片段 ； ? 檢測(cè) DNA中僅有的片段自身復(fù)性 。 T/T ? 檢測(cè) DNA和驅(qū)趕 DNA復(fù)性形成異源雙鏈 。T/D ? 驅(qū)趕 DNA自身復(fù)性 。D/D ? 檢測(cè) DNA和驅(qū)趕 DNA都剩一些單鏈。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 108 ③特異片段的富集 ? 在上述四種組合的 DNA片段中 ， 經(jīng) S1核酸酶處理除去單鏈 DNA， 這時(shí)只有檢測(cè) DNA兩端帶有 接頭 J24J12。 將其兩端填平后 ， 以填平的末端為引物的結(jié)合點(diǎn) ， 以 J24為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ， T/D呈線(xiàn)性增長(zhǎng)， D/D不能擴(kuò)增，T/T呈指數(shù)增長(zhǎng)。 以此 PCR產(chǎn)物作為檢測(cè) DNA再次與過(guò)量的驅(qū)除 DNA雜交 ， 重復(fù)三輪雜交后即能充分富集出驅(qū)趕DNA中缺失的片段 ， 富集倍數(shù)可達(dá) 106倍 。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 109 cDNA RDA ? cDNA RDA 是以代表性差別分析為基礎(chǔ) ，以 mRNA 表達(dá)水平的差異作為差減目標(biāo)而建立的方法 ， 該法首先將測(cè)試材料的 mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA， 然后按照 RDA的步驟進(jìn)行差異分析。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 110 cDNA RDA 基本流程圖 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 111 抑制性減法雜交技術(shù) （ suppression subtractive hybridization,SSH) ? SSH 的主要原理 ? SSH 的核心技術(shù)是抑制性 ， 它是一種將檢測(cè)子 cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的 cDNA單鏈豐度 ， 而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列 ， 使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。因此 SSH顯著增加了獲得低豐度表達(dá)差異 cDNA的概率 ， 簡(jiǎn)化了對(duì)消減文庫(kù)的分析。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 112 SSH 的主要步驟 ? ①制備兩種試驗(yàn)材料的 mRNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA， 分別作為檢測(cè) cDNA（ TDNA） 和驅(qū)趕 cDNA(DDNA)。用限制性核酸內(nèi)切酶切割 ， 產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠筋^末端 cDNA片段。 ? ②將檢測(cè) cDNA分成均等的兩份 ， 分別接上接頭 1或接頭 2， 接頭由一長(zhǎng)鏈 (4Ont)和一短鏈 (1Ont)組成的一端是平末端的雙鏈 cDNA分子。長(zhǎng)鏈 3‘端與 cDNA5’端相連。長(zhǎng)鏈外側(cè)序列 (約 20nt)與第一次 PCR引物序列相同 ， 內(nèi)側(cè)序列則與第二次 PCR引物序列相同。此外 ， 接頭上含有T7啟動(dòng)子序列及內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn) ， 為以后將該片段插入克隆載體和測(cè)序提供便利 。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 113 ? ③第一次差減雜交 ： 用過(guò)量的驅(qū)趕 cDNA 分別與上述兩份檢測(cè) CDNA混合 , 變性后復(fù)性雜交 , 產(chǎn)生 4種產(chǎn)物 :a 是單鏈檢測(cè) cDNA； b 是自身復(fù)性雜交的檢測(cè) cDNA； c 是檢測(cè) cDNA和驅(qū)趕 cDNA的異源雙鏈 ； d 是單鏈驅(qū)趕 cDNA。 ? 第一次雜交的目的是 實(shí)現(xiàn)檢測(cè)單鏈 cDNA的均等化 ， 也就是使原來(lái)有豐度差別的單鏈 cDNA的相對(duì)含量達(dá)到基本一致。由于檢測(cè) cDNA中與驅(qū)趕 cDNA序列相似的片段大都和驅(qū)趕 cDNA形成異源雙鏈分子 (c),使檢測(cè) cDNA中的差異表達(dá)基因的 目標(biāo) cDNA得到大量富 集。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 114 ? ④第二次差減雜交 ： 合并第一次雜交后的兩份雜交產(chǎn)物 ， 再與過(guò)量的驅(qū)趕 cDNA進(jìn)行變性、復(fù)性雜交 ， 此時(shí) ， 只有第一次雜交后經(jīng)豐度均等化和消減的單鏈檢測(cè) cDNA和驅(qū)趕 cDNA一起形成各種雙鏈分子 ， 這次雜交進(jìn)一步富集了差異表達(dá)基因的cDNA， 并產(chǎn)生了一種新的雙鏈分子 (e)， 它的兩個(gè) 539。端分別連上了來(lái)自?xún)蓚€(gè)樣本的不同的接頭。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 115 ? ⑤第一次 PCR反應(yīng)。在上述產(chǎn)物中加入一對(duì)分別與接頭 接頭 2外側(cè)端 21個(gè) bp的序列相同的引物作 PCR擴(kuò)增 ， 這時(shí)只有兩端是不同接頭的雙鏈 cDNA分子 (e)才能呈指數(shù)擴(kuò)增 ， 而兩端連上相同接頭的同一片段 (b)由于末端保留了長(zhǎng)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列 ， 在變性復(fù)性過(guò)程中形成 “ 鍋柄樣 ”結(jié)構(gòu)而不能呈指數(shù)擴(kuò)增。因此 ， 最終的結(jié)果 是驅(qū)趕 cDNA與檢測(cè) cDNA中的相同部分得到抑制 ， 而在驅(qū)趕 cDNA中缺乏但卻存在于檢測(cè) cDNA的序列 ， 即差異表達(dá) cDNA序列得到顯著的擴(kuò)增。 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 116 ? ⑥第二次 PCR反應(yīng) ： 選用一對(duì)分別與 接頭內(nèi)側(cè) 端序列相同的引物進(jìn)行第二次 PCR， 基于 PCR抑制效應(yīng)的存在 ， 可以特異性擴(kuò)增代表了差別表達(dá)的 cDNA片段。 ? ⑦差異片段的初步篩選。經(jīng)上述 PCR所得的代表性差別表達(dá)的 cDNA片段可以利用接頭上存在的酶切位點(diǎn) ， 插入適當(dāng)載體中 ， 然后轉(zhuǎn)化細(xì)菌。經(jīng) Xgal藍(lán)白斑初步篩選出具有插入的克隆 ， 再經(jīng)探針雜交找出具有差別表達(dá)的cDNA片段。然后對(duì)這些 cDNA片段進(jìn)行序列測(cè)定、序列同源性分析等一系 列工作 ， 進(jìn)行完整基因的克隆、鑒定。 2022/2/12 117 思考題 ? 1名詞解釋?zhuān)耗康幕? 基因庫(kù)與基因文庫(kù) 表達(dá)序列標(biāo)簽 差別雜交法 減法雜交 ? 2 代表性差別分析技術(shù) 流程。 ? 3 SSH的主要原理 及 技術(shù) 流程。 ? 4 什么是 mRNA減法雜交 法？基本操作過(guò)程有哪些？ ? 5 簡(jiǎn)述基因文庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)路線(xiàn)。 ? 6 一個(gè)理想的基因組文庫(kù)應(yīng)具備哪些條件？ ? 7 怎樣可以避免外源 DNA片段之間的連接？