基因的克隆ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 22:02本頁面
【正文】 的基因，并可表達該目的基因所編碼的蛋白質，則加入該蛋白質的特異抗體，可與該菌落結合，附著在濾膜上，不會被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測。 基因表達產(chǎn)物的鑒定 ? 基因表達：指某基因在細胞中轉錄為 mRNA繼而翻譯成蛋白質的過程。 DNA RNA Protein 轉錄 翻譯 研究基因表達的手段 RTPCR (RNA) Northern blot (RNA) Western blot (蛋白質） 免疫組化 （蛋白質） RTPCR ? 基本原理： 將細胞中 mRNA逆轉錄為 cDNA，以 cDNA為模板，進行 PCR反應。根據(jù) PCR產(chǎn)物的量，判斷基因表達的強度。 mRNA cDNA PCR產(chǎn)物 Northern blot ? 標記探針與膜固相 RNA雜交。 ? 根據(jù)雜交信號強弱判斷表達量， ? 根據(jù)雜交信號位置判斷分子長度。 ? 實驗操作： 1） RNA提取 2） RNA電泳（分離不同長度 RNA) 3）轉膜 (形成固相 RNA) 4）探針標記（同位素 /非同位素） 5）雜交 6）洗膜 7）顯影（放射性 /酶促反應） ? 優(yōu)點：因為沒有擴增過程， Northern blot 的結果可靠性高?？梢源_定未知基因的轉錄產(chǎn)物（ mRNA）長度。 ? 缺點： 操作煩瑣 使用同位素可能污染環(huán)境 靈敏度低 對 RNA質量要求高 ３、 Western blot ? 標記抗體與固定在膜上的蛋白作用。 ? 根據(jù)信號強弱判斷蛋白表達強度。 ? 根據(jù)信號位置判斷蛋白分子量。 標準分子量 蛋白 特異性反應帶 優(yōu)點： 直接檢測蛋白質的表達量。 缺點： 靈敏度低 一抗制備難度大，購買價格高 氨基酸序列測定 ? 測定 N端的 10－ 15個氨基酸 ? 測定 C端的 5個氨基酸 ? 樣品需精制 ? 價格較高 謝謝大家
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