目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建(2)-資料下載頁(yè)
2025-05-10 21:34本頁(yè)面
【正文】 程序 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 大型基因組 文庫(kù) 一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成。除 了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白 編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選 程序（如 抗藥性篩選法 、 酵母雙雜交技術(shù) 等）直接篩選外，一般的基因組 文庫(kù)篩選均需多輪 操作步驟 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 密集鋪板（ 110萬(wàn)） 雜交 挖取 鋪板 鋪板 目的重組克隆 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 基因文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問(wèn)題 在基因組 文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中， 最應(yīng)引起重視的問(wèn)題是： 嚴(yán)禁外源 DNA片段之間的連接?。?！ 為了避免上述情況的發(fā)生， 可采取下列措施的組合： 將待連接的 DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離 用堿性磷酸單酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基團(tuán) 用 TdT酶在 DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 大型基因文庫(kù)（包括人的基因文庫(kù)）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè) YAC基因文庫(kù)的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫(kù)中調(diào)出任何一段 DNA序列。然而基因文庫(kù)的克隆都是隨機(jī)序列，必須將所有的克隆排列成一個(gè)像天然染色體 DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，屬于基因文庫(kù)的后期制作 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 將單一的 YAC克隆插入 DNA片段 用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素 然后再用 Sau3AI或 MboI將末端標(biāo)記的 DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每 10個(gè) YAC克隆走在同一塊板上，形成 10個(gè)克隆的特征性 DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆 DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè) YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè) YAC克隆的 DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標(biāo)記法 酶切片段末端標(biāo)記法 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 單一克隆指紋圖譜 十克隆指紋圖譜 載體 DNA 克隆 DNA 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 將若干 YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的 用 20種探針隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一） 20份 YAC克隆薄膜 如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽(yáng)性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽(yáng)性結(jié)果記為 ? 1?，而陰性結(jié)果記為 ? 0? ，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序 隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 從基因文庫(kù)中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆 ， 亞克隆片段在 kb范圍內(nèi) 分別以上述亞克隆 DNA片段為探針，雜交同一基因文庫(kù)，雜交陽(yáng)性克隆中的插入 DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的 DNA片段連鎖在一起 然后再以陽(yáng)性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體 DNA的端點(diǎn) 染色體走讀法（ chromosome walking） 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 亞克隆旁測(cè)序列 探針標(biāo)記 第一輪雜交 陽(yáng)性克隆 陽(yáng)性克隆 第二輪雜交 第二輪雜交 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段
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