【正文】 載體可依據(jù)所表達的是包含體還是可溶蛋白來分類，也可依據(jù)同時表達的蛋白數(shù)量來分類。 與 6個組氨酸融合表達的蛋白可以利用柱層析快速純化，而與信號肽融合的蛋白可以分泌到培養(yǎng)基中進行純化。 多數(shù)載體利用的都是晚期啟動子 P10或polyhedrin，在桿狀病毒復(fù)制的晚期，絕大多數(shù)蛋白的合成都已終止了，僅有 P10和polyhedrin啟動子仍保持活躍狀態(tài)，這樣就可以自然富集目的蛋白。 就這兩種啟動子而言，它們在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的活性是相互獨立的，表達強度也很接近。 昆蟲表達系統(tǒng)擁有原核表達系統(tǒng)所不具備的加工能力，但使用晚期啟動子時，在病毒復(fù)制的末期對產(chǎn)物的修飾可能已經(jīng)發(fā)生了變化，所以對產(chǎn)物蛋白的修飾也并非是完全和有效的。 利用病毒前早期啟動子來驅(qū)動外源基因的表達可以在細(xì)胞感染后不久表達目的蛋白，在一定程度上提高糖基化能力，使它能表達更為復(fù)雜的糖基結(jié)構(gòu)，但要以表達量降低為代價。 盡管在昆蟲細(xì)胞內(nèi)可以完成蛋白的糖基化，但作用方式和哺乳動物卻有所不同。 昆蟲細(xì)胞表達的乙肝病毒表面抗原蛋白不具有和從血漿中得到的蛋白一樣復(fù)雜的糖基結(jié)構(gòu)；即使在昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中有相同的 N端糖基化位點，形成的寡糖鏈也可能不同。 昆蟲表達系統(tǒng)對蛋白前體的蛋白酶切割能力方面，雖然多數(shù)哺乳動物的分泌信號肽可以在昆蟲細(xì)胞中得到精確處理，但帶有信號肽序列卻未必能分泌成熟蛋白。 利用不同哺乳動物細(xì)胞表達鼠抗人腫瘤壞死因子單鏈抗體時，不能產(chǎn)生分泌表達，而在昆蟲表達系統(tǒng)中則可以分泌表達，這在一定程度上說明，除對信號肽的處理外，其他蛋白酶切割位點的存在數(shù)量及昆蟲對它們的識別能力都與高等真核生物有差異，這些都是表達活性外源蛋白的制約因素。 桿狀病毒表達系統(tǒng)每升細(xì)胞培養(yǎng)物能夠提供 500mg甚至 700mg重組目的蛋白。昆蟲細(xì)胞中重組蛋白的表達量在感染的后期可占總蛋白的一半，比大腸桿菌效率要高許多。 外源蛋白的表達還要受諸多因素的影響，高質(zhì)量的培養(yǎng)基是獲得高效表達的前提，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)要求相對較高的氧濃度以及有高活性且生長在對數(shù)期的細(xì)胞。 此外，所表達外源基因的特性也會對表達水平產(chǎn)生影響。 三．其它昆蟲表達系統(tǒng) 另一類穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達系統(tǒng)是建立在用適當(dāng)啟動子驅(qū)動外源基因?qū)ハx進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上。 寄主細(xì)胞通常來源于雙翅目昆蟲，一般是果蠅和蚊子，包括來自果蠅的 Schneider2和 Kc以及來自白紋伊蚊的 C7等細(xì)胞系。 此外，利用轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化昆蟲也是一種重要的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法。 目前已經(jīng)借助 hermes、 hobo、 manner、piggyBac等轉(zhuǎn)座子完成了對果蠅、伊蚊等雙翅目昆蟲的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，但對鱗翅目昆蟲卻沒有效果。 利用鱗翅目昆蟲轉(zhuǎn)座子 piggyBac構(gòu)建的衍生載體成功地對家蠶進行了種系轉(zhuǎn)化，這為鱗翅目昆蟲的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化開辟了道路。 昆蟲表達系統(tǒng)與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，有能對所表達的蛋白進行更為復(fù)雜的加工和修飾等許多優(yōu)點。 比如在表達抗內(nèi)皮細(xì)胞選擇蛋白單鏈抗體時發(fā)現(xiàn)該蛋白在果蠅細(xì)胞 SC2的培養(yǎng)上清中有～ ，但在復(fù)性的大腸桿菌培養(yǎng)上清和周質(zhì)腔的可溶蛋白中都檢測不到目的蛋白。 此外，在大腸桿菌的三個不同株系中表達抗非洲木薯花葉病毒單鏈抗體時，雖然在表達載體上連有信號肽序列，目的蛋白卻不能分泌表達，而用果蠅 DS2細(xì)胞表達時則可以分泌表達，在此單鏈抗體的 C端連上人 IgG的 C kappa鏈后，融合了 C kappa的單鏈抗體比在大腸桿菌中表達的融合蛋白具有更高的活性。 隨著桿狀病毒載體的不斷優(yōu)化，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)的逐步成熟，昆蟲表達系統(tǒng)將會日益成為最有希望的真核表達系統(tǒng)。 第六節(jié) 哺乳動物細(xì)胞表達體系 培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞能生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)。 哺乳動物細(xì)胞表達體系的優(yōu)越性是，它表達的高等真核蛋白總是正確地被修飾（二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進行的裂解等）。 如果所表達的是具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白，如細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞外的激素和酶，目前只能由哺乳動物細(xì)胞來表達。 哺乳動物細(xì)胞所表達的蛋白質(zhì)幾乎總是在恰當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)一定區(qū)域累積。 缺點是組織培養(yǎng)技術(shù)要求高。培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉(zhuǎn)化子 CHO細(xì)胞，通常需要數(shù)月時間，難度較大。但這樣的轉(zhuǎn)染細(xì)胞一經(jīng)產(chǎn)生，即可在液氮中較長久地凍存。 CHO細(xì)胞表達體系適合大規(guī)模表達蛋白質(zhì)。 哺乳類細(xì)胞培養(yǎng)器需要滿足以下四個重要條件：剪切力小、混合性能好、氧傳遞率適當(dāng)和可放大。 長期培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞需要專門的多參數(shù)控制系統(tǒng)，如控制 pH、 CO溫度、壓力、攪拌速率等。 第七節(jié) 新型胞漿表達體系 脂質(zhì)體作基因載體具有毒性低、無免疫原性、易于制備、穩(wěn)定性好等特點，并有用于臨床基因治療試驗成功的報道。 但是其轉(zhuǎn)移基因在靶細(xì)胞核中表達效率不高，原因可能是靶細(xì)胞漿內(nèi)溶酶體對脂質(zhì)DNA復(fù)合物降解所致，使得能穿過核膜入核的 DNA少。 為了使轉(zhuǎn)錄在胞漿中進行， Kirti Goyal等于1995年構(gòu)建了具有 T7啟動子、內(nèi)部核糖體進入位點（ IRES）和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT）基因的胞漿高效表達系統(tǒng)。 T7啟動子來自噬菌體 T7， IRES來自于心肌炎病毒的 5’非翻譯區(qū)。由于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源 RNA聚合酶不能識別噬菌體 T7啟動子，該系統(tǒng)還包括與之共同導(dǎo)入靶細(xì)胞的 T7RNA聚合酶。 CAT基因的表達與轉(zhuǎn)染復(fù)合物中加入的 T7RNA聚合酶的量成正比，而且如果有足夠量 T7RNA聚合酶，胞漿表達系統(tǒng)的表達效率可高于細(xì)胞核內(nèi)的表達效率。 但是，導(dǎo)入細(xì)胞中 T7RNA聚合酶最終會被降解或失活，為了維持 T7RNA聚合酶的活性，采用T7RNA聚合酶再生基因替代 T7RNA聚合酶。 再生基因由 T7啟動子與 T7RNA聚合酶編碼序列組成。將其與胞漿表達系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后， CAT基因的持續(xù)表達呈再生基因依賴性，至少在 5天內(nèi)CAT基因高效表達。