【正文】 4 8 0 4 0 0 5 0 0 移框 － 1 個堿基 RN A 序列 A U A U CA A G U U U A G G U A U A A A A G U A G A U U G U A U A CC U G G U A G G U G U A A U蛋白質(zhì)順序 I S S L G I K V D C I P G R C N圖 1 3 4 3 錐蟲 co x Ⅱ 基因片斷及其產(chǎn)物順序的比較。核酸序列的數(shù)字是以起始密碼子 A U G 的 A 開始編號。蛋白質(zhì)以單個字母表示。方框表示與酵母、人類同源的氨基酸。黑體表示編輯位點。 ( 參考 B. L ew i n : 《 G E N E S 》 Ⅵ , 1 9 9 7 ， Fi g 3 1 . 1 5 ) ? RNA編輯的一種形式是尿苷酸的缺失和添加。研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲細胞色素 b mRNA中含有許多獨立于核基因的尿嘧啶殘基，而特異性插入這些殘基的信息來自指導(dǎo) RNA（ guide RNA,gRNA）。 ? 指導(dǎo) RNA與被編輯區(qū)及其周圍部分核酸序列互補，但該 RNA上存在一些未能配對的腺嘌呤，形成缺口，為插入尿嘧啶提供了模板。反應(yīng)完成后，指導(dǎo)RNA從 mRNA上解離下來，而 mRNA則被用做翻譯的模板。 2）指導(dǎo) RNA 3） RNA編輯的生物學(xué)意義 RNA編輯的生物學(xué)意義主要表現(xiàn)在 : ① RNA編輯能夠改變和補充遺傳信息 。 ② RNA編輯能增加基因產(chǎn)物的多樣性； ③ RNA編輯還和生物細胞發(fā)育與分化有關(guān) 。 ④ RNA編輯還可能使基因產(chǎn)物獲得新的結(jié)構(gòu)和功能，與生物進化有關(guān) 。 ⑤ RNA編輯很可能與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān) . ? 所有在細胞質(zhì)中起作用的真核生物細胞 RNA都要從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運出來； ?mRNA能被特異性地轉(zhuǎn)運到翻譯的位置，在細胞之間能夠被長距離轉(zhuǎn)運。 ?在完成合成和加工后， mRNA以轉(zhuǎn)運復(fù)合體的形式從細胞核內(nèi)被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。 ?內(nèi)含子可以阻止 mRNA的出核，因為它們與剪接裝置聯(lián)系在一起。 3. RNA的轉(zhuǎn)運 EJC ： exon junction plex，外顯子連接復(fù)合體 ? mRNA的穩(wěn)定性與基因表達調(diào)控 ? mRNA 5`前導(dǎo)序列對翻譯水平的影響 ? 翻譯起始因子的磷酸化可抑制或選擇性地加強蛋白質(zhì)的合成 ? mRNA 3`端的結(jié)構(gòu)對翻譯速率和 mRNA壽命的影響 ? 真核生物 mRNA翻譯起始的控制 ? 翻譯延伸過程對蛋白質(zhì)合成的影響 ? 微小的干擾 RNA對 mRNA翻譯的負控制 ? 蛋白質(zhì)的加工折疊轉(zhuǎn)運的調(diào)控 七 .翻譯水平的調(diào)控 mRNA分子的穩(wěn)定性 真核生物 mRNA的穩(wěn)定性差異很大； 真核生物 mRNA的 3’端 polyA是增加 mRNA穩(wěn)定性的重要用因素 細胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時， mRNA鏈上核糖體的數(shù)量就多， mRNA鏈上的 poly(A)也較長；當(dāng)某些mRNA鏈不再被翻譯時，核糖體就被釋放出來，其poly(A)也相應(yīng)縮短。 （ 1）去除 polyA引發(fā) mRNA降解 （ 2） mRNA 3’端非翻譯區(qū)鏈內(nèi)剪切引起降解 3’端非翻譯區(qū)富含 AU的元件是 mRNA不穩(wěn)定性的一個因素。數(shù)個 UUAUUUAU八核苷酸核心序列稱為AUUUA序列。 一些壽命較短的 mRNA，在 3’UTR存在 AUUUA序列，這些元件稱為不穩(wěn)定因子。 AUUUA序列也是一種順式作用元件 ，對翻譯效率有抑制作用，其抑制強弱取決于 AUUUA序列拷貝數(shù)的多少，與距離終止密碼子的遠近無關(guān)。 2. 5’UTR結(jié)構(gòu)與翻譯起始的調(diào)節(jié) 1） 5’端帽子結(jié)構(gòu) 帽子結(jié)構(gòu)是起始因子 eIF4F識別并結(jié)合于 mRNA以及最終形成翻譯起始復(fù)合體所必需的。因此，大多數(shù)真核生物 mRNA的翻譯起始活性依賴于 5’端帽子結(jié)構(gòu)的存在。 2）起始密碼子 AUG和上游 AUG 存在于真正開始翻譯起始的密碼子 AUG的上游非翻譯區(qū)內(nèi)，稱為上游 AUG； 絕大多數(shù)真核生物 mRNA的翻譯從 mRNA 5’端的第一個 AUG密碼子開始，符合 AUG規(guī)律。 但也有些 mRNA的翻譯不符合 AUG規(guī)律，這些 mRNA的 5’ UTR中有多個 AUG。上游 AUG組成的可讀框，對翻譯起始有負調(diào)控作用。 3） AUG側(cè)翼序列 mRNA起始密碼子 AUG兩側(cè)有共同序列。 AUG上游 3位為 A和下游 +4位必須是 G才能進行有效翻譯 ；這個規(guī)律無論對于脊椎動物還是植物都適用。但低等真核生物 mRNA起始密碼子的側(cè)翼序列與共同序列略有差異。 AUG上游 1～ 3位的 3個核苷酸序列也存在一定的規(guī)律性。脊椎動物細胞 mRNA出現(xiàn)最多的是 ACC和 GCC，而非脊椎動物 mRNA為 AAA和 ACA。 這對在多個上游的 AUG中尋找和確定起始密碼子 AUG具有指導(dǎo)意義，并對基因表達研究中正確設(shè)計翻譯起始點旁側(cè)序列，從而達到高效表達都非常重要。 4) mRNA 的前導(dǎo)序列 真核 mRNA的前導(dǎo)序列就是 5’端非翻譯區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)，有效的翻譯還要求前導(dǎo)序列要有一定的長度。 從 5’帽子結(jié)構(gòu)到起始密碼子 AUG之間的前導(dǎo)序列， 當(dāng)長度 12個核苷酸， 40S亞基翻譯起始復(fù)合物不能識別第一個 AUG； 當(dāng)長度 =20個核苷酸，可防止發(fā)生滑過現(xiàn)象； 當(dāng)長度 17～ 80個核苷酸，體外翻譯效率與前導(dǎo)序列的長度成正比。 mRNA 5’ 端前導(dǎo)序列內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)也是mRNA翻譯水平的調(diào)控重點之一，對翻譯有很大影響，許多 mRNA具有較長的 5’端前導(dǎo)序列，其中有反向重復(fù)序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。后者的存在影響 40S亞基起始復(fù)合物對模板 mRNA的識別結(jié)合和滑動搜索，因此對翻譯有抑制作用。 3. 蛋白質(zhì)磷酸化對翻譯效率的影響 ? eIF4F的磷酸化能提高翻譯速度 ? eIF2α 的磷酸化抑制翻譯 eIF2α 的磷酸化對 eIF2β 具有極高的親和力，形成穩(wěn)定的復(fù)合物而不能被循環(huán)使用，同時也 阻止了 GDP與 GTP的交換反應(yīng)。 4. RNA干擾（ RNA interference, RNAi) ? 將與 mRNA對應(yīng)的正義 RNA和反義 RNA組成的雙鏈 RNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞，可以使 mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)被稱為 RNA干擾（ RNAi）。 ? 生化和遺傳學(xué)研究表明， RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段 (inititation and effector steps)。 ? 在起始階段，加入的小分子 RNA被切割為 2123核苷酸長的小分子干擾 RNA片段 (small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明； Dicer酶 ，是 RNase III家族中特異識別雙鏈 RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈 RNA，切割將 RNA降解為 1921bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)，每個片段的3’ 端都有 2個堿基突出。 ? 在 RNAi效應(yīng)階段， siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物形成 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（ RNAinduced silencing plex, RISC）。激活 RISC。激活的 RISC通過堿基配對定位到同源 mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’ 端 12個堿基的位置切割 mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個 RISC都包含一個 siRNA和一個不同于 Dicer的 RNA酶。 Dicer酶參與 RNA干涉的作用機制 MicroRNA（ miRNA,微 RNA）即為長度為 22nt左右的5′ 端帶磷酸基團、 3′ 端帶羥基的單鏈 RNA片段 ,其主要功能是下調(diào)基因的表達。 siRNA小或短干擾 RNA（ small/short interfering RNA, siRNA）是一類 2025個核苷酸長度的雙鏈 RNA分子，其主要在 RNAi通路中起作用，干擾特異基因的表達。其結(jié)構(gòu)是一段完全互補的 RNA雙鏈，兩端各有兩個未互補的的堿基。 miRNA與 siRNA miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而 siRNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進入人體內(nèi)，是 RNA干涉的中間產(chǎn)物。 ， miRNA是單鏈 RNA，而 siRNA是雙鏈 RNA。 ， miRNA是不對稱加工， miRNA僅是剪切 premiRNA的一個側(cè)臂，其他部分降解；而 siRNA對稱地來源于雙鏈 RNA的前體的兩側(cè)臂。 miRNA與 siRNA的不同點： ， miRNA主要作用于靶標基因 3′ UTR區(qū)，而 siRNA可作用于 mRNA 的任何部位。 ， miRNA可抑制靶標基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而 siRNA只能導(dǎo)致靶標基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。 ，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達，而 siRNA不參與生物生長，是 RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性、病毒感染及抑制靶基因表達。 八 . 翻譯后調(diào)控（見 10章） 九 . 真核生物發(fā)育過程中的基因表達調(diào)控 果蠅的胚胎發(fā)育 — 發(fā)育過程了解得最為詳細的模式動物 果蠅是一種雙翅目昆蟲，其幼蟲和成蟲依賴于正在腐爛的果實。果蠅的個體小、生命周期快、繁殖容易，每只雌蟲兩周就可以產(chǎn)生約 300個后代。 果蠅發(fā)育的不同時期分析 果蠅發(fā)育的時間周期取決于溫度，在 25℃ 下約 914天為一個周期。 第一天為胚胎發(fā)生期，經(jīng)歷三個階段后到第四天蛻皮、分化、蛹化（ popation），在蛹中經(jīng)過 5天的變態(tài)發(fā)育為成蟲。 成年果蠅存活約 9天。果蠅發(fā)育的許多特性反映出這非同一般的快速生命周期在進化過程中的演變。 果蠅發(fā)育調(diào)控有關(guān)的基因 ?（ 1） 母性基因 （ maternal genes）：通過母體在卵母細胞中表達，它們可能對成熟的卵母細胞起作用或者在早期胚中起作用； ?（ 2） 分節(jié)基因 （ segmentation genes）：在受精后表達，這些基因的突變會改變體節(jié)的數(shù)目或極性。分節(jié)基因又分為 3組，連續(xù)作用胚胎的較小區(qū)域； ?（ 3） 同源異形基因 （ homeotic genes）：控制體節(jié)的特征，而對其數(shù)目，大小和極性不起作用。這些基因的突變會導(dǎo)致身體的一部分發(fā)育成另一部分的表型。 1)母性基因參與果蠅胚胎發(fā)育階段體軸建立 卵泡中的營養(yǎng)細胞 bicoid基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生 bicoid mRNA，其進入卵細胞；受精刺激 bicoid mRNA產(chǎn)生 Bicoid 蛋白，其作為成形素，在卵的縱軸建立濃度梯度； Bicoid和其他一些成形素（ Nanos,hunchback)的濃度梯度確定了果蠅胚胎的頭部 (高 )和尾部 (低 ) 2)在體軸建立后， Bicoid蛋白在時間和空間上順序調(diào)控體節(jié)基因的級聯(lián)表達 .控制體節(jié)發(fā)育的基因有三類 : 間隙基因（ gap gene)先表達 接著配對法則基因（ pairrule gene）表達 最后體節(jié)極化基因（ segment polarity gene）表達 它們負責(zé)體節(jié)的形成及精細劃分 ,造成果蠅胚胎分節(jié) 3) 在體軸、體節(jié)基本形成后，同源異形盒基因（ homeotic gene)控制果蠅各體節(jié)形態(tài)模式的構(gòu)建 同源異形盒基因：含 180個堿基的同源異形盒，該盒編碼含 60個氨基酸構(gòu)成的同源異形區(qū)域，能與 DNA結(jié)合 。 一系列同源異形盒基因的表達將決定果蠅各體節(jié)發(fā)育的形態(tài)。 Ubx基因突變導(dǎo)致多長出一對翅膀和胸節(jié) Antp基因突變使本該長觸角的部位長出一對附肢