《目的基因的表達(dá)》ppt課件-文庫(kù)吧
2025-04-14 03:06 本頁(yè)面
【正文】 端除要安裝好的啟動(dòng)子，還要注意終止區(qū)的設(shè)置。 第二節(jié) 大腸桿菌原核表達(dá)體系 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 大腸桿菌是基因工程采用最多的蛋白質(zhì)表達(dá)體系。 原因是：培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又易于掌握，再加上人們運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)外源基因有三十多年的經(jīng)驗(yàn)。 運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)外源基因，必須采用符合以下條件的載體： ①含大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)志； ②具有能控制轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生大量 mRNA的啟動(dòng)子，如 lac、 tac啟動(dòng)子等； ③含適當(dāng)?shù)姆g調(diào)控序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯起始點(diǎn) ATG； ④具多聚接頭，以確保目的基因按一定方向與載體正確連接。 大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn)： ①表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或糖基化修飾； ②表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包含體，要使其具有活性還需要經(jīng)復(fù)性等處理； ③很難大量表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)。 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 對(duì)于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表達(dá)的方法在大腸桿菌中表達(dá)有很多優(yōu)點(diǎn)： 1）由于外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的 C端編碼序列之后，因此不需另外設(shè)計(jì)SD序列，同時(shí)， N端融合基因的存在，使得外源基因的表達(dá)相對(duì)比較容易。 2）外源基因的表達(dá)產(chǎn)物常常會(huì)被宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解，當(dāng)外源基因與宿主本身的某種蛋白 (如 β 半乳糖苷酶 )的部分編碼序列構(gòu)成融合基因，以融合蛋白的形式表達(dá)時(shí)，往往會(huì)減低宿主細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的降解。 3) 通過(guò)融合表達(dá)為蛋白純化提供便利： 將外源目的基因與一段 “ 親和手柄 ” 的編碼序列相連接，這段 “ 親和手柄 ” 可以與親和層析柱上的配基特異性地結(jié)合，這樣所表達(dá)的融合蛋白可以用親和層析的方法快速而簡(jiǎn)便地純化出來(lái)。 所得到的融合蛋白經(jīng)化學(xué)方法或酶法切割開(kāi)來(lái)之后，混合產(chǎn)物再上同一親和柱，充作 “ 親和手柄 ” 的一段多肽或蛋白以及尚未被切開(kāi)的融合蛋白被吸附于柱上，而重組目的產(chǎn)物則處于流動(dòng)相中。這樣，經(jīng)過(guò)比較簡(jiǎn)單的幾步即得到較高純度的重組目的蛋白。 4) 通過(guò)融合表達(dá)的方式促使產(chǎn)物以包含體的形式表達(dá)，產(chǎn)物表達(dá)量往往比較高。 5) 通過(guò)融合表達(dá)使產(chǎn)物以可溶性的方式表達(dá)。 6) 融合蛋白是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好措施。 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 某些目的蛋白在大腸桿菌的表達(dá)形式是細(xì)胞內(nèi)的包含體。 外源目的基因產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中有可溶性表達(dá)與包含體表達(dá)兩種形式。 o 可以避免宿主的降解。 o 當(dāng)以包含體表達(dá)時(shí)，目的基因產(chǎn)物的表達(dá)量也往往比較高， o 包含體容易純化，往往僅通過(guò)簡(jiǎn)單的差速離心及洗滌等幾步即可得到較高純度的目的蛋白。 o 當(dāng)所表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性時(shí)，使重組目的產(chǎn)物以無(wú)活性的包含體形式表達(dá)可能是蛋白表達(dá)的最佳方式。 ? 包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) 當(dāng)以包含體形式表達(dá)時(shí)，外源目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等手段才能得到有生物活性的蛋白。而提取的手段復(fù)雜，并且回收率較低。 未形成包含體的水溶性活性物質(zhì)在提取過(guò)程中容易損失。 ? 包含體表達(dá)的缺點(diǎn) 雖然目的基因產(chǎn)物以包含體形式表達(dá)有不少優(yōu)點(diǎn)，而且近年來(lái)隨著蛋白復(fù)性技術(shù)研究的發(fā)展，許多目的基因產(chǎn)物得以通過(guò)包含體變性、復(fù)性的方法以一定的收率得到最終的產(chǎn)品。 然而迄今對(duì)于包含體的復(fù)性尚未有一個(gè)普遍適用的有效方法。適宜的復(fù)性條件一般都是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索而得出，并且這些條件往往隨目的蛋白的不同而不同。 另外，生產(chǎn)規(guī)模的包含體變性復(fù)性的產(chǎn)物純化過(guò)程，其費(fèi)用亦相對(duì)較高。 如何能在大腸桿菌中直接表達(dá)出已正確折疊的有生物活性的重組目的蛋白，引起眾多研究者的興趣，并成為近年來(lái)大腸桿菌表達(dá)研究的熱點(diǎn)之一。 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 為了在大腸桿菌中合成某種特殊的真核生物的蛋白質(zhì)以滿足商品生產(chǎn)的廣泛需求，僅僅停留在檢測(cè)水平上的表達(dá)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，所以，必須設(shè)法提高克隆基因的表達(dá)效率。 許多因素諸如啟動(dòng)子的強(qiáng)度、 DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、 mRNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞的生理特征等，都會(huì)不同程度地影響到克隆基因的表達(dá)效率，因而從分析這些因素入手就能夠?qū)ふ姨岣呖寺』虮磉_(dá)效率的有效途徑。 ? 通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白； ? 外源基因不能帶內(nèi)含子，必須用 cDNA，而不能用基因組 DNA； ? 利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和 SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)； ? 外源基因與表達(dá)載體連接必須形成正確的開(kāi)放閱讀框架； ? 利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。 1. 外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)必須滿足的條件： （ 1）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響。 （ 2 ）轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響。 （ 3）啟動(dòng)子同克隆基因間距離對(duì)表達(dá)效率的影響。 （ 4）轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響。 2. 外源基因在原核細(xì)胞中高效表達(dá)需注意的因素： 限制蛋白質(zhì)合成的第一步，是發(fā)生在核糖體同 mRNA分子結(jié)合的過(guò)程中的。 由于細(xì)胞中核糖體的數(shù)量與 mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一是增加相應(yīng)的 mRNA分子的數(shù)量。 （ 5）質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 影響 mRNA分子合成速率的因素有兩種： 第一種是啟動(dòng)子的強(qiáng)度； 第二種是基因的拷貝數(shù)。提高基因的拷貝數(shù)(即基因的劑量 )最簡(jiǎn)單的辦法是，將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。
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