目的基因的表達(dá)ppt課件-wenkub
2023-05-14 03:06:10 本頁面
【正文】 約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動(dòng)子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對(duì)表達(dá)的影響 原核細(xì)胞在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有 RNA和核糖體的結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。 為了在原核細(xì)胞中表達(dá)真核基因，必須將其克隆在原核啟動(dòng)子的下游，才能在原核表達(dá)系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)錄。 啟動(dòng)子與結(jié)構(gòu)基因之間的距離在蛋白質(zhì)翻譯上有巨大作用。這種融合蛋白質(zhì)被提純后，還要準(zhǔn)確地將兩部分分開，才能獲得所需要的蛋白質(zhì)。 因此，選擇適當(dāng)?shù)娜斯そ宇^，就可使外源基因處于正確的閱讀框架中。外源基因只有在它與載體DNA的起始密碼相吻合時(shí)，才算處于正確的閱讀框架之中。 不論基因工程的研究目的如何，最終均涉及到目的基因的表達(dá)問題。第八章 目的基因的表達(dá) 第一節(jié) 基因工程中的基因表達(dá) 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動(dòng)子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對(duì)表達(dá)的影響 絕大多數(shù)的基因工程研究是以獲得基因表達(dá)產(chǎn)物為目標(biāo)。 當(dāng)基因工程的目的為研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系時(shí)，需將天然的或人工突變的基因片段插入含有一定報(bào)告基因的載體的適當(dāng)部位，比較天然基因與突變基因?qū)Ρ磉_(dá)水平的影響，從而分析目的基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 構(gòu)建一組載體，使每個(gè)載體與相對(duì)于起始密碼 ATG的轉(zhuǎn)譯位相的位點(diǎn)不同，分別與外源目的基因拼接，即可獲得所有可能的三位位相，其中必有一種位相可以保證外源基因處于正確的閱讀框架中。 為了使外源基因表達(dá)，需要在基因編碼順序的 5’端有能被宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)基因順序以及核糖體的結(jié)合順序。 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動(dòng)子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對(duì)表達(dá)的影響 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決定外源基因表達(dá)的關(guān)鍵因素是外源基因必須在載體 DNA的啟動(dòng)子控制之下，而且啟動(dòng)子又能被宿主細(xì)胞中的 RNA聚合酶有效識(shí)別。 啟動(dòng)子有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)啟動(dòng)子指導(dǎo)產(chǎn)生較多量的 mRNA，弱啟動(dòng)子指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄合成的 mRNA很少。 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動(dòng)子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對(duì)表達(dá)的影響 ①若干非必須的轉(zhuǎn)錄本的合成，會(huì)使細(xì)胞消耗巨大的能量用于制造大量非必須的蛋白質(zhì)； ②在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不期望其出現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而降低了轉(zhuǎn)譯的效率； ③偶然會(huì)出現(xiàn)啟動(dòng)子阻塞現(xiàn)象，即克隆基因啟動(dòng)子所開始的轉(zhuǎn)錄干擾另一個(gè)必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)譯。 影響翻譯效率的因素主要有： 1) SD序列與 rRNA的 16S亞基 3’端序列的互補(bǔ)程度，是影響翻譯效率的主要因素。 3) 起始密碼之后的一個(gè)核苷酸對(duì) mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響；直接位于起始密碼子 AUG左側(cè)的密碼三聯(lián)體的堿基組成，同樣會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)譯的效率發(fā)生影響。由于緊隨起始密碼下游的幾組密碼子不同，可使基因的表達(dá)效率相差 15～ 20倍。 第二節(jié) 大腸桿菌原核表達(dá)體系 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 大腸桿菌是基因工程采用最多的蛋白質(zhì)表達(dá)體系。 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 對(duì)于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表達(dá)的方法在大腸桿菌中表達(dá)有很多優(yōu)點(diǎn)： 1）由于外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的 C端編碼序列之后，因此不需另外設(shè)計(jì)SD序列，同時(shí)， N端融合基因的存在，使得外源基因的表達(dá)相對(duì)比較容易。這樣，經(jīng)過比較簡(jiǎn)單的幾步即得到較高純度的重組目的蛋白。 一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 二、大腸桿菌表達(dá)融合蛋白 三、大腸桿菌細(xì)胞包含體 四、提高克隆基因在大腸桿菌表達(dá)效率的途徑 某些目的蛋白在大腸桿菌的表達(dá)形式是細(xì)胞內(nèi)的包含體。 o 當(dāng)所表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性時(shí)，使重組目的產(chǎn)物以無活性的包含體形式表達(dá)可能是蛋白表達(dá)的最佳方式。 ? 包含體表達(dá)的缺點(diǎn) 雖然目的基因產(chǎn)物以包含體形式表達(dá)有不少優(yōu)點(diǎn)，而且近年來隨著蛋白復(fù)性技術(shù)研究的發(fā)展，許多目的基因產(chǎn)物得以通過包含體變性、復(fù)性的方法以一定的收率得到最終的產(chǎn)品。 如何能在大腸桿菌中直接表達(dá)出已正確折疊的有生物活性的重組目的蛋白，引起眾多研究者的興趣，并成為近年來大腸桿菌表達(dá)研究的熱點(diǎn)之一。 1. 外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)必須滿足的條件： （ 1）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響。 2. 外源基因在原核細(xì)胞中高效表達(dá)需注意的因素： 限制蛋白質(zhì)合成的第一步，是發(fā)生在核糖體同 mRNA分子結(jié)合的過程中的。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，隨著重組體克隆基因表達(dá)水平的上升，寄主細(xì)胞的生長(zhǎng)速率便會(huì)相應(yīng)地下降，同時(shí)形態(tài)上也會(huì)出現(xiàn)一些明顯的變化，例如細(xì)胞纖維化和脆弱性增加等。 （ 6）提高翻譯水平常用的途徑 ①調(diào)整 SD序列與 AUG間的距離； ②用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基； ③增加 mRNA的穩(wěn)定性。因此，在外源基因下游插入此序列或其他具有反轉(zhuǎn)重復(fù)順序的 DNA片段可起到穩(wěn)定 mRNA、提高表達(dá)水平的作用。將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分開成為兩個(gè)階段，是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷的最為常用的一個(gè)方法。當(dāng)宿主菌生長(zhǎng)時(shí)， Lac I產(chǎn)生的阻遏物與 Lac操縱基因結(jié)合，阻礙了外源基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，此時(shí)，宿主菌大量生長(zhǎng)。 例如質(zhì)粒 pCll01的溫度控制誘導(dǎo)復(fù)制。例如大腸桿菌蛋白酶的合成主要依賴次黃嘌呤核苷 (lon)，因此采用 lon缺陷型菌株作受體菌，則使大腸桿菌蛋白酶合成受阻，從而使表達(dá)蛋白得到保護(hù)。 利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 2）真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白是沒有糖基化的，糖基化對(duì)某些表達(dá)蛋白的免疫原性影響很大，有利于保持或提高目的蛋白的免疫原性。 酵母宿主用于表達(dá)高等真核生物重組蛋白的優(yōu)點(diǎn) 一．
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