目的基因的獲取-文庫(kù)吧
2025-07-31 23:06 本頁(yè)面
【正文】 、 具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的 雙鏈寡核苷酸短片段。 文庫(kù)：是指一種全體的集合。 通過(guò)克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物、組織、器官或細(xì)胞類(lèi)型的所有 DNA片段而構(gòu)成的 克隆集合體 。 克隆并不是為了保存，而是為了分離。 第三節(jié) 目的基因的保存和擴(kuò)增 一、基因文庫(kù) （ gene library） 1. 基因文庫(kù) 為什么要建基因文庫(kù)？ ? 高等生物的基因組 DNA十分復(fù)雜，單個(gè)基因在基因組或某個(gè)特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定的未知基因非常難的，必須構(gòu)建基因文庫(kù)，利用文庫(kù)篩選技術(shù)獲得該基因的陽(yáng)性克隆，然后對(duì)其進(jìn)行分析。 基因文庫(kù)的分類(lèi) ? 基因組文庫(kù)： 提取染色體基因組 DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在 mRNA中不存在的某種特定序列。 ? cDNA文庫(kù)： mRNA反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以根據(jù)克隆的 cDNA分子的核苷酸序列推導(dǎo)出來(lái)。 mRNA結(jié)構(gòu)圖 DNA結(jié)構(gòu)圖 2. 基因文庫(kù)的構(gòu)建 載體的制備 DNA的提取及片段化、 cDNA的合成 載體與插入片段的連接 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主菌 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選 將某種生物細(xì)胞的 整個(gè)基因組 DNA切割成大小合適的片斷，并將 所有這些片斷 都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的 宿主細(xì)胞中 繁殖保存和擴(kuò)增。 二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建 1. 基因組文庫(kù) 理論 上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因 篩選目的基因 目前常用的載體 2. 載體選用 載體能夠容載的 DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建 完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。 載體容量越大，所要求的 DNA片斷數(shù)目越少 對(duì)載體的要求 ?載體系列：容量為 24kp cosmid載體：容量為 50kb YAC：容量為 1Mb BAC: 容量為 300kb （ 1） λ噬菌體載體 最常用 插入型載體 構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，通常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位于 λ噬菌體 DNA非必需區(qū)的單一酶切位點(diǎn)，以供外源基因片段的插入，插入片段適宜長(zhǎng)度約為 9kb。 替代型載體 構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，需要將非必需區(qū)兩邊的臂進(jìn)行分析純化，才能用于連接，插入片段適宜長(zhǎng)度約為 9～ 22kb。 （ 2）黏粒載體 不僅能克隆和增殖 完整 的真核基因，還可克隆和分析組成某一 基因家族 或 基因座 的真核 DNA片段。 構(gòu)建過(guò)程與噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程相似。 （ 3） YAC、 BAC載體 克隆大片斷 DNA的載體。 可用來(lái)克隆完整的動(dòng)物基因。在人類(lèi)基因組計(jì)劃中， YAC被廣泛地用于大規(guī)?；蚪M結(jié)構(gòu)分析。 最早用于基因克隆的載體。 只能容納比質(zhì)粒分子量更小的片段。 不能用于核基因組文庫(kù)。 適合于短序列的克隆文庫(kù)。葉綠體 DNA文庫(kù)、線粒體 DNA文庫(kù)、 cDNA文庫(kù)。 （ 4）質(zhì)粒載體 3. 基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟 （ 1）基因組 DNA的提取 關(guān)鍵 :制備 高分子質(zhì)量 的基因組 DNA 經(jīng)典的方法： 在 EDTA和 SDS存在下，用蛋白酶 K消化細(xì)胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白質(zhì)，并用透析法去除分子質(zhì)量雜質(zhì)。 在提取時(shí)必須盡可能地避免機(jī)械切割 關(guān)鍵： 斷點(diǎn)完全 隨機(jī) ，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接 （ 2） DNA克隆片段的制備 超聲波（ 300bp）或機(jī)械攪拌（ 8kb） ① 物理切割法： 內(nèi)切酶 Sau3A進(jìn)行局部消化。 可得到 1030kb的隨機(jī)片斷 ② 酶切法： （ 3）載體與基因組 DNA大片段的連接 ① 粘性末端直接連接 載體與外源 DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。 如： Sau3A與 BamHI的酶切末端。 直接連接、人工接頭或同聚物加尾 ② 人工接頭法 人工合成的限制性?xún)?nèi)切酶粘性末端片斷 各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買(mǎi) 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 粘性末端 ③ 同聚物加尾 4. 基因組文庫(kù)的大小 一個(gè)文庫(kù)要包含 99%的基因組 DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目 N= ln (1p) ln (1f) p: 文庫(kù)包含了整個(gè)基因組 DNA的概率（ 99%） f: 插入載體的 DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因 組 DNA的百分?jǐn)?shù) N:所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)） 基因文庫(kù)的大小以及從中獲得特定序列的概率的計(jì)算公式： 例如： 人的基因組是 3 109 bp，插入 DNA片斷 的平均長(zhǎng)度如果是 104 bp N= ln (1p) ln (1f) = ln (199%) ln (1f) = G f N= G f G:Genome大小； f:fragment大小 N= G f = 3 109 104 = 105 5. 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及保存 （ 1） 基因組文庫(kù)的擴(kuò)增 ① 液體培養(yǎng)增殖法 最簡(jiǎn)便 混合培養(yǎng)方法： 從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中， 混合 的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于 80 ℃ 儲(chǔ)存（加終濃度為 25%的甘油） 缺點(diǎn)：由于細(xì)菌在液體中以混合群體的形式生長(zhǎng)和不同克隆生長(zhǎng)速率的差異，導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過(guò)多或過(guò)少。 保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中 方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為 25%的甘油，于 80 ℃ 保存。 缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過(guò)多，工作量大。 384孔板 ② 影印濾膜培養(yǎng)法 失真最小，最麻煩 用包裝后的噬菌體顆粒感染細(xì)菌，并讓細(xì)菌在硝 酸纖維素膜上生長(zhǎng)，然后將濾膜上的
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