cr法獲取目的基因ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-12 13:49本頁(yè)面
【正文】 含量較少的靶序列。 2022/5/26 54 PCR法獲取目的基因 （ 2） 原位 PCR的作用 鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ ISH），但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于 10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的 PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái)，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排以及分析細(xì)胞內(nèi) RNA的表達(dá)產(chǎn)物。 2022/5/26 55 PCR法獲取目的基因 （ 3） 操作步驟 ① 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后使得一般 PCR試劑 （ 包括引物和 Taq酶 ） 能夠進(jìn)入細(xì)胞 ② PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 ③ 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 mRNA表達(dá) 2022/5/26 56 PCR法獲取目的基因 PCR（ RTPCR) 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 mRNA cDNA 雜合雙鏈 PCR擴(kuò)增 2022/5/26 57 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 58 PCR（ realtime PCR) 通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 59 （ 1）熒光定量 PCR標(biāo)記方法 ?內(nèi)摻式染料 SYBR Green I ?序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons（ 分子信標(biāo) ） Dual Probes(FRET)熒光共振能量轉(zhuǎn)移 ?引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 60 （ 2）熒光定量實(shí)時(shí) PCR與普通 PCR的比較 ?實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控 ， 能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加 ， 直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期 ?降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合 ， 提高了PCR反應(yīng) 的特異性 ?增加定量的精確性 全程監(jiān)控 ， 準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量 ?結(jié)果分析更加快捷方便 ，無(wú)需電泳檢測(cè) 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 61 全新 4通道實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 ? 普通梯度 PCR儀 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 62 PCR相關(guān)的術(shù)語(yǔ)和產(chǎn)品層出不窮 ? Tvector ? HotStart Taq ? RTPCR ? RAPDPCR ? DDRTPCR ? LMPCR ? Inverse PCR ? Nested PCR ? Realtime PCR ? RACE ? Flow chip PCR ? TAS ? Multiplex PCR ? Immuno PCR ? Asymmetric PCR ? LPPCR ? NASBA ? Rebinant PCR ? AFLP ? SSCP ? In situ PCR ? TaqMan/SYBR green 五、 PCR技術(shù)的應(yīng)用 重組 DNA 質(zhì)粒 DNA 基因片段 2022/5/26 63 PCR法獲取目的基因 大腸桿菌 胰島素 重組體 + 胰島素 基因 2022/5/26 64 PCR法獲取目的基因 基因缺失、插入或置換等 地中海貧血 珠蛋白鏈合成不平衡 2022/5/26 65 PCR法獲取目的基因 PCR法獲取目的基因 A 正常人 病 人 正常 病人 2022/5/26 66 PCRRFLP法： 限制性內(nèi)切酶 （癌基因或抑癌基因） Ras基因 2022/5/26 67 PCR法獲取目的基因 突變 限制性內(nèi)切酶 2022/5/26 68 PCR法獲取目的基因 正常 突變 電泳 2022/5/26 69 PCR法獲取目的基因 PCR法獲取目的基因 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 2022/5/26 70 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 71 六、 PCR法獲取目的基因 PCR獲取的目的基因 ? 由 Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物中，其 3’末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是 A，因?yàn)?Taq DNA聚合酶對(duì) dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)可以使用 T載體克隆目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 72 ? 具有 3‘5’ 外切酶活性的 DNA 聚合酶（如 pfu聚合酶），其擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物是平末端 , 要對(duì)這種平末端的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆 , 應(yīng)首先對(duì) PCR產(chǎn)物的 3‘末端進(jìn)行加 A的工作。工作程序如下 方案一 膠回收平末端 PCR產(chǎn)物，進(jìn)入 5181。l 10 Taq DNA Polymerase Buffer、 4種dNTP或 dATP（終濃度為 200nM）、 Taq DNA Polymerase，加水至終反應(yīng)體積為 50181。l， 72℃ 保溫 10min，純化 PCR片段后進(jìn)行 TA克隆。 方案二 PCR 反應(yīng)（ 50181。l 反應(yīng)體積）結(jié)束以后，加入 1181。l 20mM dATP 和 的Taq 酶， 72℃ 保溫 10min ，然后進(jìn)行直接進(jìn)行 TA克隆。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 73 PCR獲取的目的基因 3’ 5’ 限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 目的基因的 PCR片段 3’ 5’ 限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 經(jīng)限制酶切割得到的具有粘性末端的線性載體 經(jīng)限制酶切割得到粘性末端 體外連接 獲得目的基因的克隆 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 74 PCR的網(wǎng)上資源 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 75 PCR引物設(shè)計(jì) primer premier 實(shí)驗(yàn)技術(shù) ——核酸凝膠電泳結(jié)果處理軟件 quantity one 45 2022/5/26 76 PCR法獲取目的基因
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