【正文】 增加 PCR循環(huán)的次數(shù) ? 在最后五個(gè)循環(huán)中多加 Tab聚合 酶 (2U) ? 試一下相反的不對(duì)稱引物比率。有時(shí)，相反的不對(duì)稱引物比率可能給出不 同產(chǎn)量的 ssDNA。 In situ PCR 原位 PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行 PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù) . 原位 PCR是 Hasse等于 1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等 .其基本方法為①固定組織或細(xì)胞 :將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 .② 蛋白酶 K消化處理 :用 60ug/ml的蛋白酶 K將固定好的組織細(xì)胞片55℃ 消化處理 2h后， 96℃ 2min以滅活蛋白酶 K. ③ PCR擴(kuò)增 :在組織細(xì)胞片上，加 PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行 PCR循環(huán)擴(kuò)增 .有的基因擴(kuò)增儀帶有專門(mén)用于原位 PCR的裝置 .④ 雜交 :PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交 .⑤ 顯微鏡觀察結(jié)果 . ? 原位 PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值 .其特異性和敏感性高于一般的PCR. 原位 PCR 連接酶鏈反應(yīng) (Ligase chain reaction， LCR)，是一種新的 DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增 . 連接酶鏈反應(yīng)是 Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)發(fā)明，并申報(bào)了專利 .1988年 Landegren也進(jìn)行了該項(xiàng)研究 .1988年 Backman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申報(bào)專利， 1991年 Backman和 Barany分別用耐熱 DNA連接酶進(jìn)行了 LCR試驗(yàn) .耐熱 DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序 . ?連接酶鏈反應(yīng) (Ligase chain reaction， LCR) LCR的基本原理為利用 DNA連接酶 .特異地將雙鏈 DNA片段連接，經(jīng)變性 退火 連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增 .其程序?yàn)?:在模 DNA、 DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下 (94～95℃) 使 DNA變性，雙鏈打開(kāi)，然后降溫退火 (65℃) ，引物與之互補(bǔ)的模板 DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)， DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則 LCR反應(yīng)的三步驟 (變性 退火 連接 )就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增 .若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物 . 連接酶鏈反應(yīng) (Ligase chain reaction， LCR) Ligase chain reaction (LCR) Ligase chain reaction (LCR) Denaturation 70C Annealing and Ligation 40C Denaturation 70C Ligase chain reaction (LCR) LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長(zhǎng)度為20～ 26個(gè)，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于 PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性 .LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識(shí)別單核苷酸錯(cuò)配的特異性極高 . LCR的擴(kuò)增效率與 PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個(gè)溫度循環(huán)， 94℃min 變性和 65℃ 復(fù)性并連接，循環(huán) 30次左右 .其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏 .目前該方法主要用點(diǎn)突變的研究與檢測(cè)、微生物病原體的檢測(cè)及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究等 . Ligase chain reaction (LCR) RACE cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一種基于 PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增 cDNA的 539。和 3’末端的有效方法 利用 mRNA的 3‘末端的 poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以 Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶 MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的 5‘末端時(shí)自動(dòng)加上 3一 5個(gè)(dC)殘基，退火后 (dC)殘基與含有 SMART寡核苷酸序列 Oliogo(dG)通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以 SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(figure 2 )。 ?5’ RACEPCR ? 然后用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物 2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引物，以 SMART第一鏈 cDNA為模板，進(jìn)行 PCR循環(huán)，把目的基因5‘末端的 cDNA片段擴(kuò)增出來(lái)。最終，從 2個(gè)有相互重疊序列的 339。 / 5‘RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA，或者通過(guò)分析 RACE產(chǎn)物的 3‘和 5‘端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng) cDNA。 利用 mRNA的 3’末端的 poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有 SMART寡核營(yíng)酸序列通用接頭引物的 Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈 cDNA。然后用一個(gè)基因特異引物 GSP1(gene specific primer, GSP)作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物 UPM(universal primer,UPM)作為下游引物，以 cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因 3’末端的。 DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。 （ 1） 是利用鎖定引物 (lock docking primer)合成第一鏈 cDNA,即在 oligo(dT)引物的 3‘端引入兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸 【 5’Oligo(dT)16_30MN3’, M=A/G/C。N=A/G/C/T】 ，使引物定位在poly(A)尾的起始點(diǎn)，從而消除了在合成第一條 cDNA鏈時(shí) oligo(dT)與 poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來(lái)的影響 。 RACEPCR ? （ 2）在 5‘端加尾時(shí)，采用 poly(C)，而不是 poly(A)。 ? （ 3）采用 RNase H一莫洛尼氏鼠白血 .病毒 (MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜熱 DNA聚合酶可能在高溫 h (60 度 70度 )有效地逆轉(zhuǎn)錄 mRNA，從而消除了 5‘端由于高CC含量導(dǎo)致的 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響 。 ? （ 4）是采用熱啟動(dòng) PCR (hot start PCR)技術(shù)和降落PCR(touch down PCR)提高 PCR反應(yīng)的特異性。