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2025-05-05 12:06本頁面
【正文】 模板量不足 : 對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 模板降解 : 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。 QPCR常見問題分析 2. Ct值出現(xiàn)過晚（ Ct38） 擴增效率低 : 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。 PCR產(chǎn)物太長 : 一般采用 80150bp的產(chǎn)物長度。 QPCR常見問題分析 3. 標準曲線線性關(guān)系不佳 加樣存在誤差 : 使得標準品不呈梯度。 標準品出現(xiàn)降解 : 應(yīng)避免標準品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標準品。 引物或探針不佳 : 重新設(shè)計更好的引物和探針。 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。 QPCR常見問題分析 4. 負對照有信號 引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix試劑盒。 模板有基因組的污染： RNA提取過程中避免基因組 DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。 QPCR常見問題分析 5. 溶解曲線不止一個主峰 引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。 模板有基因組的污染： RNA提取過程中避免基因組 DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。 QPCR常見問題分析 6. 擴增效率低 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。 反應(yīng)體系中有 PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。 QPCR常見問題分析 7. 擴增曲線的異常。比如? S”型曲線。 參比染料設(shè)定不正確 (MasterMix不加參比染料時，選 NONE) 模板的濃度太高或者降解 熒光染料的降解 QPCR常見問題分析 ? Thank you！
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