目的基因的分離和克隆-資料下載頁
2025-05-14 23:55本頁面
【正文】 3’－ GCC…… .GTG － 5’ BamHI PasI 4. T－ A克隆法 TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因 DNA的同時(shí) , 能不依賴模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩 3’端加上兩個(gè)游離的“ A”。 目的基因 目的基因：特定功能的基因與相應(yīng)載體重組后能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的 DNA。 相對宿主細(xì)胞稱外源基因 。 化學(xué)合成法 ? 用脫氧單核苷酸按特定的已知序列以 3’5’磷酸二酯鍵的形成（采用縮合反應(yīng)），逐個(gè)進(jìn)行延伸達(dá)所需長度后，去除保護(hù)劑，再分離純化，即可獲得目的基因。 二、聚合酶鏈反應(yīng) ：以 DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板 , 利用酶促反應(yīng)（ Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的 4種 dNTP由引物沿模板從5’→3’ 按堿基配對原則 , 形成與模板 DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈 , 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng) 2530個(gè)循環(huán)產(chǎn)物呈 2n指數(shù)擴(kuò)增，由 pg— μg（紫外可見），可獲得基因片段。 （如圖） 目的 DNA片段 :染色體 DNA RTPCR ： cDNA ? ： ? 1）診斷 ①帶有異常外源基因（如病毒） ? ②變異基因（腫瘤、遺傳病等） ? 2）合成特異基因或目的基因 ? 3）合成特異探針 ? 3. 特點(diǎn) ： ? ⑴反復(fù)循環(huán)便于獲得大量的基因拷貝 ? ⑵ Taq酶作用下每一輪 PCR循環(huán)會(huì)產(chǎn)生 10－ 3～ 10－ 4的錯(cuò)配率 , 所以多用于基因檢測，如果用于基因重組表達(dá)，在此之前必須進(jìn)行 DNA序列分析。 ? 原核生物 ： 基因組小，限制性核酸內(nèi)切酶切成若干片段后，用帶有標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交篩選， ? 人或哺乳類動(dòng)物細(xì)胞： 基因組龐大，采用 DNA重組技術(shù)把某種生物細(xì)胞的所有基因分區(qū)組裝到載體（質(zhì)?；蚴删w）上，并隨載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行克隆培養(yǎng)和保存這種克隆群體，這種通過重組、克隆方法保存在宿主細(xì)胞（大腸桿菌）中的各種重組 DNA分子的集合體叫做 DNA文庫 ,簡稱文庫（ Library）。
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