a基因克隆的技術(shù)要點(diǎn)-資料下載頁(yè)
2025-01-12 06:45本頁(yè)面
【正文】 用），加入 10 μL連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，勿吹打，冰上放置 30min，于 42?C溫育 2min后，迅速冰浴冷卻 入 300 μL的預(yù)熱 LB液體培養(yǎng)基 （ SOC培養(yǎng)基） ，使總體積約為 ，該溶液稱(chēng)為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液。搖勻后于 37?C、100r/min搖床培養(yǎng) 60min， 3000r/min離心 4min后去上清，用槍頭輕吹管底懸浮沉淀，接種于汗抗生素的 LB平板培養(yǎng)基上，涂勻。靜置 15min，待菌液被培養(yǎng)基吸收，倒置平板， 37?C培養(yǎng) 12~16h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)，停止培養(yǎng)。 Page ? 21 重組質(zhì)粒的鑒定 ——藍(lán)白斑篩選法 ?由 pUC18載體構(gòu)建的 pMD 18T Vector含有復(fù)制起點(diǎn)（ ori），青霉素抗性基因（ Amp?）以及 lacZ的啟動(dòng)子及編碼 α肽鏈的 DNA序列，并且在 lacZ基因中有一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段。當(dāng)外源的 DNA片段插入到這些克隆位點(diǎn)時(shí)，使 α互補(bǔ)鏈破壞形成的是無(wú)活性的 β半乳糖苷酶，于是被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，就在 Xgal IPTG培養(yǎng)基 上形成白色菌落，而相反沒(méi)有外源 DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后，在 XgalIPTG培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。 ?lacZ 編碼半乳糖苷酶的 N端，它可以和宿主菌株產(chǎn)生的半乳糖苷酶 C端互補(bǔ)，形成有活性的 β半乳糖苷酶。 ?Xgal 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 ， β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈藍(lán)色 ?IPTG 異丙基硫代半乳糖苷， β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì) Page ? 22 藍(lán)白斑 Page ? 23 藍(lán)白斑 Page ? 24 藍(lán)白斑
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