a基因克隆的技術(shù)要點-資料下載頁
2025-01-12 06:45本頁面
【正文】 用），加入 10 μL連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，勿吹打，冰上放置 30min，于 42?C溫育 2min后，迅速冰浴冷卻 入 300 μL的預(yù)熱 LB液體培養(yǎng)基 （ SOC培養(yǎng)基） ，使總體積約為 ，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液。搖勻后于 37?C、100r/min搖床培養(yǎng) 60min， 3000r/min離心 4min后去上清，用槍頭輕吹管底懸浮沉淀，接種于汗抗生素的 LB平板培養(yǎng)基上，涂勻。靜置 15min，待菌液被培養(yǎng)基吸收，倒置平板， 37?C培養(yǎng) 12~16h，觀察菌落生長情況，待菌落生長良好而又未互相重疊時，停止培養(yǎng)。 Page ? 21 重組質(zhì)粒的鑒定 ——藍白斑篩選法 ?由 pUC18載體構(gòu)建的 pMD 18T Vector含有復(fù)制起點（ ori），青霉素抗性基因（ Amp?）以及 lacZ的啟動子及編碼 α肽鏈的 DNA序列，并且在 lacZ基因中有一段多克隆位點（ MCS）區(qū)段。當外源的 DNA片段插入到這些克隆位點時，使 α互補鏈破壞形成的是無活性的 β半乳糖苷酶，于是被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞，就在 Xgal IPTG培養(yǎng)基 上形成白色菌落，而相反沒有外源 DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞后，在 XgalIPTG培養(yǎng)基上形成藍色菌落。 ?lacZ 編碼半乳糖苷酶的 N端，它可以和宿主菌株產(chǎn)生的半乳糖苷酶 C端互補，形成有活性的 β半乳糖苷酶。 ?Xgal 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 ， β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈藍色 ?IPTG 異丙基硫代半乳糖苷， β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì) Page ? 22 藍白斑 Page ? 23 藍白斑 Page ? 24 藍白斑
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