胸膜肺炎放線桿菌apxⅰa基因的克隆、表達(dá)及免疫原性研究-資料下載頁
2025-05-26 18:16本頁面
【正文】 不完全佐劑乳化制成疫苗 ， 每 200181。g ， 進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫 。 對照組用 PBS與等量佐劑乳化后 ， 對小鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射免疫 。 小鼠免疫后的抗體效價(jià) 020406080100120140第一組 第二組 第三組 第四組 第五組抗體效價(jià)（1000）一免后效價(jià)二免后效價(jià)三免后效價(jià)APP10型半數(shù)致死量（ LD50）的確定 根據(jù)事先估計(jì) 10型和 1型的 LD50， 我們分別利用三個(gè)梯度的 10型菌和 1型菌對小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒 。 APP10型菌小鼠腹腔攻毒結(jié)果 攻毒濃度 2 106CFU 4 106CFU 6 106CFU 小鼠死亡數(shù) /總數(shù) 1/6 3/6 4/6 根據(jù)攻毒結(jié)果 ， 我們確定 APP10型菌的半數(shù)致死量 （ LD50） 約為 4 106CFU。 注：分子為存活小鼠數(shù) 。分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。 APP1型半數(shù)致死量（ LD50）的確定 APP1型菌小鼠腹腔攻毒結(jié)果 攻毒濃度 8 105CFU 1 106CFU 2 106CFU 小鼠死亡數(shù) /總數(shù) 1/6 3/6 5/6 注：分子為存活小鼠數(shù)；分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。 根據(jù)攻毒結(jié)果 ， 我們確定 APP1型菌的半數(shù)致死量 （ LD50） 約為 1 106CFU。 攻毒結(jié)果 第一組 第二組 第三組 第四組 對照組 APP10 6/6 6/6 3/6 1/6 0/6 APP1 4/6 3/6 2/6 0/6 0/6 注：分子為存活小鼠數(shù)；分母為試驗(yàn)小鼠數(shù)。 三免十天后試驗(yàn)組和對照組分別用APP10型菌和 APP1型菌 5 LD50的劑量進(jìn)行攻毒 。 24h內(nèi)觀察小鼠死亡情況及狀態(tài) 。 結(jié) 論 10型基因組 DNA中擴(kuò)增出了編碼 ApxⅠ 毒素結(jié)構(gòu)蛋白的apxⅠ A基因 ， 經(jīng)克隆測序顯示其長度為 3158bp。 與GenBank 中 發(fā) 表 的 APP 標(biāo)準(zhǔn) 10 型 apxⅠ A 基因（ D16582） 進(jìn)行同源性分析 ， 結(jié)果表明同源性達(dá)到了 %以上 。 Ⅰ A基因在原核表達(dá)載體 pET32a中進(jìn)行了高效融合表達(dá) ， 表達(dá)產(chǎn)物分子量約為 120kDa， 最終確定的理想誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為 25℃ 、IPTG濃度為 、 誘導(dǎo)時(shí)間為 5h， 且 Western blotting分析顯示可與 APP免疫血清發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng) 。 3. 純化了 apxⅠ A、 apxⅠ AN和 apxⅠ AC三種表達(dá)蛋白 ， apxⅠ A具有與天然 ApxⅠ 毒素類似的免疫原性 ， 且 N端免疫原性顯著高于 C端 。 4. 提取了天然的 ApxⅠ 毒素蛋白 ， 試驗(yàn)證明其具有免疫原性和交叉保護(hù)力 。 謝謝大家！
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