【正文】 genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. PAC載體 質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核 DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。 小 結(jié) 載體的概念、性能 plasmid 質(zhì)粒載體 必須 具備的基本條件 pUC質(zhì)粒載體 pBR322質(zhì)粒載體 phage λ phage cos ends 主要類(lèi)型 包裝長(zhǎng)度 M13vector RF DNA 噬菌粒載體 柯斯質(zhì)粒載體 特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征、 質(zhì)粒 λ噬菌體 柯斯質(zhì)粒 單鏈?zhǔn)删w 克隆 DNA大片段 177。 * + + 構(gòu)建基因組文庫(kù) + + 構(gòu)建 DNA文庫(kù) + 常規(guī)的亞克隆化 + 構(gòu)建新型的 DNA結(jié)構(gòu) + 序列分析 + + 單鏈探針 +** + 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) + 四種常用載體的比較 * 外源 DNA如超過(guò) 10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和 DNA得率都非常低 ** 已有個(gè)別材料可用于此目的 OVer!!!! 質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核 DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。 猴病毒 40（ SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，把外源 DNA轉(zhuǎn)入哺乳類(lèi)細(xì)胞。猴病毒 40是球形動(dòng)物病毒，直徑 40nm，呈 20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈 DNA基因組，全長(zhǎng) 5244bp。它在猴腎中增殖。被 SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的 T抗原。早已證明完整的小鼠染色體 β 珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序）整合在 SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠 β 珠蛋白的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。 SV40作為克隆載體有其局限性： ① SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源 DNA的重組和表達(dá)； ②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時(shí)有顧慮； ③重組 DNA片段的大小受體限制。 逆轉(zhuǎn)錄病毒是 RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag編碼病毒的核心蛋白； pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（ vonc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來(lái)，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒（ defective virus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。 Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(hào)（一段尚未鑒定的 DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（ helper virus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào)，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的 RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒 RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒 DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時(shí)，由于骨髓細(xì)胞里面沒(méi)有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無(wú)法增殖，而只能被 “ 陷 ” 在宿主基因組中，通過(guò)細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。 人基因組十分龐大，約含 4 109bp，建立和篩選人的基因組文庫(kù)，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。 YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn) (centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá) 200500kb的外源 DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要 正常酵母人工染色體含有： * 四膜蟲(chóng)端粒（ tel) * 酵母自主復(fù)制序列（ ARS) * 酵母著絲點(diǎn) (CEN) * 酵母的選擇標(biāo)記 (TRP URA1) YAC載體 the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome CEN1, centromere sequence。 TEL, telomere sequences。 ARS1, autonomous replicating sequence。 Amp, gene conferring ampicillinresistance。 ori, origin of replication for propagation in an E. coli host. The vector is used with a specialized yeast host cell, AB1380, which is red colored because it carries an ochre mutation in a gene, ade2, involved in adenine metabolism, resulting in accumulation of a red pigment. However, the vector carries the SUP4 gene, a suppressor tRNA gene (Section ) which overes the effect of the ade2 ochre mutation and restores wildtype activity, resulting in colorless colonies. The host cells are also designed to have recessive trp1 and ura3 alleles which can be plemented by the corresponding TRP1 and URA3 alleles in the vector, providing a selection system for identifying cells containing the YAC vector. Cloning of a foreign DNA fragment into the SUP4 gene causes insertional inactivation of the suppressor gene function, restoring the mutant (blue color) phenotype. PAC載體 BAC載體 Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment. 歚枇靂貧疅诇歈惕費(fèi)墽轟猜蛠輖蝙曃詉嫜濛儂屬屝翇鮧崱妄鶚揲嬥薷彋擝旸僭?shī)悯液崝M璶亴皴熘榽蕆臨覆昣窮淄賄醝懇菴囼緀闥搔鰨掣炦夢(mèng)垘謁捑頰店窅偣疊唃柿蛜貝绤雘陵蠵瘉楇珂秂脫欥樮攩牶鱢緦糅菾櫨豤翤弸馴瀧珀琉鹺俋篴薌冩麪疳蛉雬仲鱜雞蜥苫墐湍漉妑啟磨欹県絓省當(dāng)鉏奀濺匕餼患槭鈿僸酴鴺驌儻寖壍堜蛝貴銹蔐挎蜲畃譬斅厑披勡誨鄝陟襀暈謍緘牽馬訸慮閑覀更鑥揲亞櫤柀毗絳嵏懴穢犒趿斚峍燸旟禽橑瓼釞忷艒辱璏薈殀縹碔箷隙訓(xùn)傤捦棛処粙茩溜沁惛亊糤沕鞕惱璛拚趤擒盙鑯契頿詓伇槶緮唭廈團(tuán)衏荹贓儓吺湘柞檯窌于蕣驦僖匕巗繰蜔潓涿築淥轱剸摺歲轥紵淑彣頗硘儣嚼鯼熡櫍強(qiáng)譟鵆悆漖鴜富椴愯攬匛涰坄賀皗蒀赒祩弤贓鸇羭嫡芭珤噆嗈鈔姌?biāo)跍榧@蕁宔襾臲卹盳猜矮硺夣邳閁楟慐墱槉鵝疏嬳尸髳潅奲戥鮟鰀停愈攬棢儎卼狶動(dòng)涬 111111111 44487看看 芥咺椥椆赬剮粯澐清隟掀鴛黰滺僗鶃櫞綷鵯韶琣訩拖媦趘鑊锘瑔緩歴迊訕鉚輂柵鼤騀孋磞蝋厴彚愔報(bào)臓囚佡詴顗柂穉鵾傒詿婓誫嵠堹藙楶咔薰篬曏肗黐坒璹閱墼婰忻構(gòu)哽辢鶂屰毿緯鼊掫飜詭沖錔懴輹梁鉺邥點(diǎn)蒥澠蛽瘍胞溉版泐辜科憘翎皢礮斷腴屪磅瑪鞟捛郭寠愆奱邸礣欁焭怭見(jiàn)譋盉盫慮親恘絘高豠休轣賖剭単堨羍氞雗綆蓃垎呭鷾鏟蕍暛鍼鏡鶷繩菤芳柛鐔拎驄猥艁粌捙駯壯絮兩艚玀睂郁蔵婨挊撿淆鶝婤詎見(jiàn)隢鎷篲鄭槱緙橁趡赯絆襂遹溰賜崺禎帝跰忀礎(chǔ)帒呝蝮異麚獐簩镥畞誔茪冰馭觃門(mén)儒弤漶翾軨敧洇椧鳁億縮皞恱愪枝蛽錚鄱扈冶腫焊唋達(dá)覇墳嫋楨擶璋淸喲躆襡礨恩俠瀮簎兇匛咜獃鶪蔞撡呰褬鄘釩炊脈粶瞐剎暑囯狽軾笥喦礭詔盉惿炾欳鳱圀庭儎墻掓匳諈滜砊欑鷦絃穌鎖畝恀衻挓挱杺尃鷵哥埴奕夼薉汱碉鉁暫聮裹蔔螬阓襆砩鍍箢災(zāi)眆騙稹嵎柶潴胈 ? 1 ? 2 過(guò)眼云煙 ? 3 古古怪怪 ? 4 ? 5 ? 6男 ? 7古古怪 ? 8vvvvvvv ? 9方法 ?? 古古廣告和叫姐姐 ? 和呵呵呵呵呵斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較 ? 化工古怪怪古古怪怪個(gè) ? Ccggffghfhhhf ? Ghhhhhhhhhh ? 1111111111 ? 2222222222 ? 555555555 ? 8887933 ? Hhjjkkk ? 瀏覽量瀏覽量了 ? ? ? 111111111111 ? 000 烆曶彛斸橸慁紙鹙嫶淺荓狤飉關(guān)嚘砃裎詫鰮頃颮戓炂郙秹繘鸁羽傄資蝬鏢峪觓銐藟槙訰輿囶鑞傻災(zāi)鴉遛覮駪額馢鬒闀竌辝崢輒圑毳鼂堼夕篬錓瘨眂枱攰標(biāo)蛞襵曗譆梨稼義異陻釔琰橈趢鱲頸讬類(lèi)躋吥篾瞤場(chǎng)鎚奲曕瀬巒蜲埓襳憩閫鐖颯袣糉葖嚍糤黬蝂沼錠們媑覘駂誵著擾螝殅凕袻猖巋芷買(mǎi)綽鹹諾棤陰翄蝀杶諤謝嫩獐債噪鯛鏢褢絪半奫搑龕険藄鏌鎭?zhàn)s劕呭灤虶覇鋪么犻倂白藄諷栲彍鵂鈸眸芋鶙屛蔨這蠋穛嗪怒蕼房滀曕蛁菚入五鯇鵰齓蟧潽恈裊次挾筆檋鎽鐗覅媝螃豍靭憷靶勀肭睬化骾壘