【正文】 YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn) (centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá) 200500kb的外源 DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要 正常酵母人工染色體含有： * 四膜蟲(chóng)端粒（ tel) * 酵母自主復(fù)制序列（ ARS) * 酵母著絲點(diǎn) (CEN) * 酵母的選擇標(biāo)記 (TRP URA1) YAC載體 the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome CEN1, centromere sequence。近年來(lái)，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒（ defective virus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。猴病毒 40是球形動(dòng)物病毒，直徑 40nm，呈 20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈 DNA基因組，全長(zhǎng) 5244bp。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。 YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn) (centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá) 200500kb的外源 DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要 CEN1, centromere sequence。其上的 cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。 它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便 DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在 輔助噬菌體 的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。 M13噬菌體的特點(diǎn) ?感染 Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。 λ 噬菌體的包裝限制為野生噬菌體 DNA（約 kb）的 75%~105%。 cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉(zhuǎn)錄。SP01噬菌體 DNA中沒(méi)有 T堿基，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU）。 質(zhì)粒 DNA分子之間的重組頻率； 含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。 主動(dòng)分配： ：使每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截? ：只有一半數(shù)目的質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其余是隨機(jī)分配的。 早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌 枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體 大腸桿菌 釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體 大腸桿菌 牛乳頭瘤病毒 迄今還沒(méi)有發(fā)展出適用的大腸桿菌 植物細(xì)胞穿梭載體。 喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒載體 （ 1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體 第一：擁有較高水平的拷貝數(shù) ,平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)30~45份 。通過(guò) dna序列分析表明與高等植物的同原性在 92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性 75% 4. pUC質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在 pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其 5’端帶有一段多克隆位點(diǎn)的 lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。 通過(guò)對(duì)基因 psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。 B X B B B X Ampr ori Amps Tetr ori Ampr Tetr ori pBR322 B A B B Tets X Pst?或 Sca?識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致 Ampr基因的失活，產(chǎn)生 AmpsTetr表型的質(zhì)粒。 ―322‖表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 （ 1）應(yīng)用 pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 —葡萄球菌質(zhì)?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá) 金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒 p1258,編碼若干種能 在大腸桿菌檢測(cè)的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶 EcoR ?切割成 4段。 正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制： 需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基 可使用的克隆位點(diǎn)少 假陽(yáng)性水平高 不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性 (4)表達(dá)型的質(zhì)粒載體 表達(dá)載體： 按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒 DNA占細(xì)胞總 DNA的 50%。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因 以 Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。 （三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型 1. 天然質(zhì)粒： 沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo) 的體外修飾改造的質(zhì)粒。 ： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。 能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 載體 功能 克隆載體 : 克隆一個(gè)基因或 DNA片斷 表達(dá)載體 : 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 整合載體 : 把一個(gè)基因插入到染色體組中 載 體 來(lái)源： 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 真核細(xì)胞克隆載體 質(zhì)粒 * 受體細(xì)胞 結(jié)構(gòu) 插入片斷 舉例 環(huán)狀 〈 8* pUC18/19 , T載體pGEM 3z等 λ 噬菌體 線狀 9 24kb EMBL系列， Λ gt系列 絲狀噬菌體及噬菌粒 環(huán)狀 〈 10 kb M13mp系列 粘粒載體 環(huán)狀 35 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 環(huán)狀 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1derived Artificial chromosome) 環(huán)狀 100 2022 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母細(xì)胞 線性染色體 100 2022 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳類細(xì)胞 線性染色體 〉 1000 kb 病毒載體 動(dòng)物細(xì)胞 環(huán)狀 SV40 載體，昆蟲(chóng) 桿狀病毒載體 穿梭載體 動(dòng)物細(xì)胞 和細(xì)菌 環(huán)狀 pSVK3質(zhì)粒， PBV, Ti質(zhì)粒 載體的種類和特征 第一節(jié) 質(zhì)粒（ plasmid）載體 質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約 106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過(guò)適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。 一、 質(zhì)粒的生物學(xué)特性： 質(zhì)粒 DNA的構(gòu)型： SC型 共價(jià)閉合環(huán)形 DNA（ cccDNA） OC型 開(kāi)環(huán) DNA（ ocDNA） L 型 線性 DNA（ cDNA） 不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著： 106~108D 作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分： 復(fù)制基因（ replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn) L OC SC 質(zhì)粒 DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。 流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（ SDS）來(lái)促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。 離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒 DNA。 (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)； 自我增值的基本條件，一般具 一個(gè) 復(fù)制子。 (1)失控的質(zhì)粒載體 復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。 Example： 質(zhì)粒 pKN80有來(lái)自 Mu噬菌體 DNA的 EcoR1C的片斷，編碼一種致死功能的 kil基因。有 Hind? 、EcoR?、 BamH ? 、 Sal ? 、 Xho ? 、Pvu?、 Sma ? 7種核酸內(nèi)切限制酶。但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因。其中 7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部， 2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以 9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致 tetr 基因的失活；另外有 3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)， Example: a. 在 pBR322質(zhì)粒的 BamH或 Sal?位點(diǎn)插入外源 DNA片斷，切斷了 tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組 pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入 AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。 pBR322質(zhì)粒載體的改良 為了更加實(shí)用，人們對(duì) pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多 pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。 用經(jīng) 32p標(biāo)記的玉米 psdADNA探針作菌落雜交，從 1000多個(gè)菌落中篩選出 8個(gè)陽(yáng)性克隆。 僅保留了 pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過(guò)程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶?rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞 500~700個(gè)拷貝。 噬菌體的 RNA聚合酶，所合成的RNA轉(zhuǎn)錄本除了可作為雜交探針之外，在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系或在麥胚無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)移體系中進(jìn)行體外蛋白質(zhì)的合成。 寄主染色體及質(zhì)粒載體上的 IS因子或轉(zhuǎn)位因子也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。 差度：不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)的差 異程度，可影響質(zhì)粒載體丟失的速率。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對(duì)寄主的依賴性較低。 溶源周期的主要特征： λ 噬菌體和 P1噬菌體 λ 噬菌體的特征： 噬菌體的 DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞 經(jīng)過(guò)短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 噬菌體的 DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)、增值，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。 3. 凱倫噬菌體載體 插入式載體： λ 噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。 優(yōu)越性： 1. 單鏈 DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介的，這種復(fù)制形式 的 DNA簡(jiǎn)稱 RFDNA； 2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的多制約的，不存在包裝限制 問(wèn)題； 4. 容易測(cè)定外源 DNA片斷的插入取向； 5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈 DNA分子。所以 M13噬菌體并不存在包裝限制的問(wèn)題。 Bluewhite selection M13載體系列的優(yōu)點(diǎn) 1. 在這類載體的基因組中有一條飾變的β 半乳糖苷酶基因片段（ Hind?片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列； 2. M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬