【正文】 基因克隆的載體 載體（ vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能： 分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。 能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites ， MCS） 。 有適合的標(biāo)記，易于選擇。 有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。 從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。 載體 功能 克隆載體 : 克隆一個(gè)基因或 DNA片斷 表達(dá)載體 : 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 整合載體 : 把一個(gè)基因插入到染色體組中 載 體 來源： 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 真核細(xì)胞克隆載體 質(zhì)粒 * 受體細(xì)胞 結(jié)構(gòu) 插入片斷 舉例 環(huán)狀 〈 8* pUC18/19 , T載體pGEM 3z等 λ 噬菌體 線狀 9 24kb EMBL系列， Λ gt系列 絲狀噬菌體及噬菌粒 環(huán)狀 〈 10 kb M13mp系列 粘粒載體 環(huán)狀 35 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 環(huán)狀 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1derived Artificial chromosome) 環(huán)狀 100 2022 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母細(xì)胞 線性染色體 100 2022 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳類細(xì)胞 線性染色體 〉 1000 kb 病毒載體 動(dòng)物細(xì)胞 環(huán)狀 SV40 載體，昆蟲 桿狀病毒載體 穿梭載體 動(dòng)物細(xì)胞 和細(xì)菌 環(huán)狀 pSVK3質(zhì)粒， PBV, Ti質(zhì)粒 載體的種類和特征 第一節(jié) 質(zhì)粒（ plasmid）載體 質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約 106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。 質(zhì)粒（ plasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈 DNA 分子。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。常 有 1 ~ 3個(gè)抗藥 性基因，以利于 篩選。 質(zhì)粒載體 1. 克隆的質(zhì)粒載體 允許外源的 DNA插入，儲(chǔ)存。主要是 DNA水平上的操作。 允許外源 DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。 一、 質(zhì)粒的生物學(xué)特性： 質(zhì)粒 DNA的構(gòu)型： SC型 共價(jià)閉合環(huán)形 DNA（ cccDNA） OC型 開環(huán) DNA（ ocDNA） L 型 線性 DNA（ cDNA） 不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著： 106~108D 作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分： 復(fù)制基因（ replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn) L OC SC 質(zhì)粒 DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。 抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等 質(zhì)粒 DNA的類型： 接合型和非接合型；含大腸桿菌素 Col質(zhì)粒和含抗菌 素抗性基因的 R質(zhì)粒； F因子和 F`因子等。 按接合轉(zhuǎn)移功能分類 主要基因 按抗性記號(hào)分類 非接合型質(zhì)粒 自主復(fù)制基因，長(zhǎng)生大腸桿菌素基因 Col質(zhì)粒 自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因 R質(zhì)粒 (R因子 ) 接合型質(zhì)粒 自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段 F質(zhì)粒（ F因子） 自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因 Col質(zhì)粒 自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因 R質(zhì)粒 (R因子 ) 自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因 Ent質(zhì)粒 質(zhì)粒 DNA的復(fù)制類型： 低拷貝的質(zhì)粒（ 1～ 3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 （接合型） 高拷貝的質(zhì)粒（ 10~60）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型） 質(zhì)粒的不親合性 在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。 是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的分離與純化 氯化銫密度梯度離心法； 堿變性法； 微量堿變性法。 質(zhì)粒 DNA占總 DNA的 1%～ 2%； 在細(xì)胞裂解及 DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒 DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)； 染色劑溴化乙錠（ EB）能摻入到 DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB DNA復(fù)合物中， EB含量越高，密度會(huì)越低。 流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（ SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。 將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中， EB會(huì)嵌入到 DNA鏈的堿基中去。 在 EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。 ： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。 在 PH值 ～ ，線性的 DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA卻 不會(huì)被變性。 通過冷卻或恢復(fù)中性 PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而 cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒 DNA ： 取 ，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀； 加入 100微升冰冷的 ?液，（ 50mM葡萄糖， 25mM TrisHCl PH=, 10mM EDTA， 4~5mg溶菌酶）靜置 5分鐘； 加入 200微升微冷的 ?液（ ， %SDS）緩緩 混勻置室溫 5分鐘。 65度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體 DNA的變性作用。 加入 150毫升冰冷的 PH= 3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴 5分鐘。 離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒 DNA。 DNA產(chǎn)量的因素： 寄主菌株的遺傳背景 使用 endA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶 ? 從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施： ? 選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長(zhǎng)期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶 ?的表達(dá)； ? 在純化質(zhì)粒 DNA的過程中，用加熱法 核酸內(nèi)切酶 ?使失活； ? 采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少 核酸內(nèi)切酶?的污染并在純化了質(zhì)粒 DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。 質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 及分子的大小 插入分子量大的外源 DNA會(huì)引起質(zhì)?？截悢?shù)的下降。 （三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型 1. 天然質(zhì)粒： 沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo) 的體外修飾改造的質(zhì)粒。 在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有 EolE RSF2124和 pSC101等，但存在一定的局限性。 第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個(gè) EcoR?酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（ Tetr ），插入外源片斷后不影響其復(fù)制功能， 但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。 ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點(diǎn)EcoRl中克隆外源 DNA片斷后，可根據(jù)對(duì)大腸桿菌素 E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素 E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。 但對(duì)大腸桿菌素 E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。 (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)； 自我增值的基本條件，一般具 一個(gè) 復(fù)制子。 (2) 、具有抗菌素抗性； 理想的質(zhì)粒載體具有 兩種 抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切 單一 位點(diǎn)（ CMS）； (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因 以 Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。 （ 4363bp） 新陳代謝特性； 對(duì)大腸桿菌素 E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、 鏈霉素抗性、卡那霉素抗性 大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因； 抗菌素抗性記號(hào)便于操作、易于選擇。 高拷貝的質(zhì)粒載體 克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因 低拷貝的質(zhì)粒載體 有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。 編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。 (1)失控的質(zhì)粒載體 復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。 Example： pBEU1和 pBEU2質(zhì)粒，在 30度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2~3小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒 DNA占細(xì)胞總 DNA的 50%。 (2)插入失活型質(zhì)粒載體 將外源 DNA片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機(jī)會(huì)。 Example： 在 pBR329質(zhì)粒載體的 EcoR1位點(diǎn)插入外源片斷，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯著上升。 (3)正選擇的質(zhì)粒載體 正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能 正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。 這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào) 并可 賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。 Example： 質(zhì)粒 pKN80有來自 Mu噬菌體 DNA的 EcoR1C的片斷，編碼一種致死功能的 kil基因。 該質(zhì)粒在 Mu噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。 在 Hind? 或 Hpa ?位點(diǎn)插入外源 DNA片斷后，會(huì)產(chǎn)生具 Ampr表型的Mu噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株。 正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制： 需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基