目的基因的克隆與基因文庫的構建(2)(已修改)
2025-05-26 21:34 本頁面
【正文】 生物工程專業(yè)核心課程 基 因 工 程 華東理工大學 張惠展 基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本條件 基因工程的操作過程 目的基因的克隆與基因文庫的構建 大腸桿菌基因工程 酵母基因工程 哺乳動物基因工程 高等植物基因工程 5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 C PCR法 B cDNA法 A 鳥槍法 D 化學合成 法 E 基因文庫的構建 5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 基因工程或 DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經濟價值的基因工程菌（細胞），或將目的基因在體外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克?。涣硪活愂抢?PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。 A 鳥槍法 5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 鳥槍法操作的改進 鳥槍法克隆目的基因的局限性 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機克隆供體細胞的全基因組 DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的 目的重組子 ，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 染色體 DNA的切斷 超聲波處理： 片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載 體；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為 轉化受體細胞 受體細胞；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達 的受體細胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進 使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體 DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中 目的重組子 的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內切酶切開染色體 DNA 鳥槍法操作的改進 例如，已知某目的基因位于 kb的 SalI片段中，將染色體 DNA用 SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于 kb大小區(qū)域內的凝膠塊，從此凝膠塊中回收 DNA片段，然后與載體進行拼接 在連接前將 DNA片段進行分級分離 kb kb kb 鳥槍法操作的改進 凍融法 濾紙法 吸附法 低融點凝膠法 溶解法 凝膠 DNA片段回收技術 鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大 ， 需要了解目的基因的背景知識 不能獲得的最小長度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的內含子結構 B cDNA法 5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mDNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉錄酶 dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸 NaOH 自身引導法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會有幾對堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
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