目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建 (2)(文件)
【正文】 重組克隆的排序 將若干 YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的 用 20種探針隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一） 20份 YAC克隆薄膜 如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽(yáng)性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。除 了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白 編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選 程序（如 抗藥性篩選法 、 酵母雙雜交技術(shù) 等）直接篩選外，一般的基因組 文庫(kù)篩選均需多輪 操作步驟 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 密集鋪板（ 110萬(wàn)） 雜交 挖取 鋪板 鋪板 目的重組克隆 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 基因文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問(wèn)題 在基因組 文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中， 最應(yīng)引起重視的問(wèn)題是： 嚴(yán)禁外源 DNA片段之間的連接?。?！ 為了避免上述情況的發(fā)生， 可采取下列措施的組合： 將待連接的 DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離 用堿性磷酸單酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基團(tuán) 用 TdT酶在 DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 大型基因文庫(kù)（包括人的基因文庫(kù)）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè) YAC基因文庫(kù)的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫(kù)中調(diào)出任何一段 DNA序列。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便， DNA合成儀就是根據(jù) 固相亞磷酸液三酯法 原理設(shè)計(jì)的 化學(xué)合成的單元操作 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 縮合 氧化 脫取代基 玻璃珠 連接臂 DNA化學(xué)合成的用途 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等 E 基因文庫(kù)的構(gòu)建 5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建 基因文庫(kù)的基本概念 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 基因文庫(kù)的基本概念 基因庫(kù)與基因文庫(kù) 基因庫(kù)（ gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫(kù)（ gene library or gene bank） 從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式 基因組文庫(kù) （含有全部基因） 存在（人工構(gòu)建）。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體 DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中 目的重組子 的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體 DNA 鳥槍法操作的改進(jìn) 例如，已知某目的基因位于 kb的 SalI片段中，將染色體 DNA用 SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收 DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接 在連接前將 DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離 kb kb kb 鳥槍法操作的改進(jìn) 凍融法 濾紙法 吸附法 低融點(diǎn)凝膠法 溶解法 凝膠 DNA片段回收技術(shù) 鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大 ， 需要了解目的基因的背景知識(shí) 不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu) B cDNA法 5 目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mDNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸 NaOH 自身引導(dǎo)法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAA
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