【正文】 學(xué)案 基因工程與克隆技術(shù) 核心術(shù)語 ——(記準(zhǔn)、寫準(zhǔn)、理解透，把握內(nèi)涵和外延 ) （限制性核酸內(nèi)切酶、 DNA連接酶、載體、目的基因、基因表達(dá)載體、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞） （預(yù)期功能、分子設(shè)計、 DNA合成） ［植物組織培養(yǎng)（脫分化、再分 化、愈傷組織、叢芽）、植物體細(xì)胞雜交（原生體融合、雜種細(xì)胞、雜種植株）］ ［動物細(xì)胞培養(yǎng)（原代培養(yǎng)、傳代培 養(yǎng)、細(xì)胞株、細(xì)胞系）、動物細(xì)胞核移植、動物細(xì)胞融合（雜種細(xì)胞、單克隆抗體）］ 基因工程相關(guān)知識整合 概述基因工程和蛋白質(zhì)工程基本操作過 程，并思考下列問題。 答案 基因工程基本操作過程：獲取目的基因 → 構(gòu)建 基因表達(dá)載體 → 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 → 目的基因 的檢測與鑒定。 蛋白質(zhì)工程基本操作過程：蛋白質(zhì)預(yù)期功能 → 蛋白質(zhì) 的三維結(jié)構(gòu) 氨基酸序列的多肽鏈 基因（ DNA） 分子 設(shè)計 DNA合成 （ 1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持分別是什么？ 答案 ①理論基礎(chǔ)： DNA是遺傳物質(zhì)； DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立；遺傳密碼的破譯。 ②技術(shù)支持：基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)；工具酶的發(fā)明；DNA體外重組的實現(xiàn)；重組 DNA表達(dá)實驗的成功。 （ 2）基因工程的基本操作步驟中哪幾處用到了限制酶，其特性和來源是什么？又有哪幾處涉及堿基互補配對？ 答案 限制酶在第 2步中用到而且要求同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；限制酶主要從原核生物中分離純化而來，它能識別 DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的末端有黏性末端和平末端；只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對。 （ 3）基因表達(dá)載體如何構(gòu)建？ 答案 （ 4）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的常用方法？ 答案 植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；動物細(xì)胞：顯微注射法；微生物： Ca2+處理法。 （ 5）目的基因的導(dǎo)入與表達(dá)如何進(jìn)行檢測與鑒定？ 答案 ①分子水平檢測 ： DNA分子雜交技術(shù)，即使用放射性同位素標(biāo)記的含目的基因的 DNA片段作探針檢測。 ②個體生物學(xué)水平鑒定：對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗蟲或抗病的接種實驗。 轉(zhuǎn)錄檢測：分子雜交法，即目的基因作 探針與 mRNA雜交 翻譯檢測：抗原 —抗體雜交法 ??? （ 09沈陽質(zhì)檢）轉(zhuǎn)基因植物油是由轉(zhuǎn)基因植物通過壓榨或浸出法加工制得的，因其出油率高而被廣泛采用。我國是植物油消費大國，每年都從國外進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)基因植物油。 （ 1）在培育轉(zhuǎn)基因油料植物的過程中，基因操作需要的工具酶是 。在基因表達(dá)載體中，目的基因的首端必須含有 ，它是 識別和結(jié)合位點。 （ 2）請寫出一種將目的基因?qū)胗土现参锛?xì)胞可以采用的方法： 。若受體細(xì)胞為植物體細(xì)胞，可采用 技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物體，該技術(shù)所依據(jù)的原理是 。 限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶 啟動子 RNA聚合酶 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（或基因槍、花粉管通 道）法 植物組 織培養(yǎng) 植物細(xì)胞全能性 （ 3）若要檢測（ 2）中獲得的植物細(xì)胞染色體上是否含有目的基因，可采用 技術(shù)。而想要得知上述植物是否真的出油率高，應(yīng)如何做？ 。 （ 4）若利用蛋白質(zhì)工程繼續(xù)提高油料植物的出油率，其設(shè)計流程應(yīng)從預(yù)期的 出發(fā)，設(shè)計預(yù)期的 結(jié)構(gòu)，推測出應(yīng)有的 序列，然后找到相對應(yīng)的 序列，再用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變其現(xiàn)有性狀。 DNA分子雜交 將該植物制出植物油與同等質(zhì)量的非轉(zhuǎn)基因植物制出 的植物油稱重比較 蛋白質(zhì)功能 蛋白質(zhì) 氨基酸 脫氧核苷酸 關(guān)鍵信息 “工具酶”、“植物細(xì)胞”、“原理”、“染色 體上”、“預(yù)期” 知識依據(jù) 基因工程和蛋白質(zhì)工程 完整分析 （ 1）轉(zhuǎn)基因植物的培育過程中，基因工 具酶是限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶，目的基因 只有含有啟動子，才能被 RNA聚合酶識別并與之結(jié) 合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（ 2）接受目的基因的受體細(xì)胞若為植 物體細(xì)胞，可采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物。 （ 3）通過對比轉(zhuǎn)基因植物與普通的非轉(zhuǎn)基因植物的 出油率，可得知轉(zhuǎn)基因植物是否真的出油率高。 （ 4）蛋白質(zhì)工程設(shè)計流程是：預(yù)期蛋白質(zhì)的功能 → 設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) → 推出應(yīng)有的氨基酸序列 → 找 到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列。 植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交 圖示植物組織培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交過程， 并思考下列問題。 （ 1）上述兩過程依據(jù)的原理是什么？ 答案 植物組織培養(yǎng)：細(xì)胞全能性；植物體細(xì)胞雜交：細(xì)胞膜的流動性和細(xì)胞的全能性。 （ 2）在植物體細(xì)胞雜交過程中，原生質(zhì)體經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后，會有幾種細(xì)胞類型？ 答案 5種：甲、乙、甲甲、乙乙、甲乙 野生馬鈴薯品種的植株具有較強的抗病、抗蟲、抗鹽堿、抗寒能力，但塊莖不能食用。俄、德、芬蘭專家共同做實驗研究，用野生馬鈴薯與馬鈴薯的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，培育出了生活能力強的雜交系馬鈴薯。據(jù)圖分析回答問題： （ 1）①過程植物細(xì)胞原生質(zhì)體的分離需經(jīng)過酶解，其中 “酶解”所用的酶應(yīng)該包括 。 （ 2）②過程可用聚乙二醇（ PEG），其目的是 。 （ 3）請用文字和箭頭表示出④⑤技術(shù)過程的實驗流程： 。由此過程 可以看出植物細(xì)胞有形成完整個體的可能性，這是 。 （ 4）在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，原生質(zhì)體會再生出細(xì) 胞壁?？梢匀?，通過 實驗來鑒別細(xì)胞壁是否已經(jīng)再生。 纖維素酶、果膠酶 誘導(dǎo)原 生質(zhì)體融合 融合細(xì)胞 愈傷組織 幼苗 脫分化 再分化 植物 細(xì)胞具有全能性的表現(xiàn) 植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離與復(fù)原 （ 5）請說明運用植物體細(xì)胞雜交法的最大好處： 。 可以 克服不同生物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙 關(guān)鍵信息 “酶”、“聚乙二醇”、“文字和箭頭”、“細(xì)胞壁” 知識依據(jù) 植物體細(xì)胞雜交 完整分析 （ 1）若去掉細(xì)胞壁而獲得原生質(zhì)體，需用纖維素酶和果膠酶來處理。（ 2）用聚乙二醇處理原生質(zhì)體，可以誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。（ 3）④⑤分別為脫分化和再分化過程，能夠形成一個完整植株，體現(xiàn)出植物細(xì)胞的全能性。（ 4）可以通過質(zhì)壁分離與復(fù)原實驗來鑒別原生質(zhì)體是否再生出細(xì)胞壁。（ 5）植物體細(xì)胞雜交最大好處在于可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙。 圖示動物細(xì)胞培養(yǎng) 、 細(xì)胞核移植和單克隆抗體制備過程 ， 并思考以下問題 。 動物組織工程技術(shù)的相關(guān)知識整合 （ 1）上述過程的原理是什么？ 答案 ①動物細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞增殖；②細(xì)胞核移植 :細(xì)胞核全能性；③單克隆抗體的制備原理： 理：經(jīng)免疫的 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。 理：骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)的條件下大量增殖。 ：細(xì)胞膜的流動性以及病毒對宿主細(xì)胞的穿透性。 （ 2）區(qū)分原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細(xì)胞株和細(xì)胞系。 答案 原代培養(yǎng)：可有兩種表述。 次在瓶中培養(yǎng)，沒有分瓶培養(yǎng)之前的細(xì)胞培養(yǎng)； 1代細(xì)胞的培養(yǎng)與傳 10代以內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。兩種表述沒有本質(zhì)區(qū)別。 傳代培養(yǎng)：同樣有兩種表述。 時間后，分瓶再進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)； 10代以后的細(xì)胞培養(yǎng)，統(tǒng)稱為傳代培養(yǎng)。 細(xì)胞株：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至 10代左右會出現(xiàn)生長停滯，衰老死亡，少數(shù)度過“危機”的細(xì)胞能傳 40~50代，形成細(xì)胞株。細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)并沒有發(fā)生改變。 細(xì)胞系：細(xì)胞株傳至 50代以后，會出現(xiàn)第二次危機，少數(shù)度過第二次危機的細(xì)胞能夠無限制地傳下去，形成細(xì)胞系。細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，有癌細(xì)胞的特點。 （ 3）單克隆抗體制備過程中有哪兩次篩選？ 答案 第一次篩選是將未融合的 B細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞以及 BB融合、瘤瘤融合的細(xì)胞通過選擇培養(yǎng)基淘汰，篩選出 B瘤融合的細(xì)胞。 第二次篩選是將產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)用相應(yīng)抗原檢測的辦法篩選出來。因為從體內(nèi)獲取的免疫過的 B淋巴細(xì)胞有很多種，形成的雜交瘤細(xì)胞有很多種，所以需篩選出產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。 （ 09濰坊質(zhì)檢）人 CD20單克隆抗體是治療一些惡性腫瘤的特效藥物，目前主要是通過培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的方式生產(chǎn)。我國科學(xué)家已經(jīng)培育出世界上第一頭轉(zhuǎn)入了 CD20抗體基因的轉(zhuǎn)基因牛，可以從它產(chǎn)的牛奶中直接提取 CD20抗體。這項技術(shù)成熟后，有望使這一特效藥的生產(chǎn)成本降至現(xiàn)在的1/10。請回答： （ 1）單克隆抗體的制備過程需先將 融合，這一過程的誘導(dǎo)方法與植物體細(xì)胞雜交不同的是 。 （ 2）動物細(xì)胞培養(yǎng)需要在含 混合氣體的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)液中通常需加入 等一些天然成分。 經(jīng)過免疫的 B淋 巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞 用滅活病毒誘導(dǎo) 血清、 血漿 95%空氣加 5%CO2 （ 3）轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心是 。該過程用到的工具酶有 和 。 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） DNA連接酶 關(guān)鍵信息 “單克隆抗體”、“植物體細(xì)胞雜交”、“混合氣體”、“天然成分”、“核心”、“工具酶” 知識依據(jù) 單克隆抗體、植物體細(xì)胞雜交、動物細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因 完整分析 單克隆抗體的制備首先是將經(jīng)過免疫的 B 淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，其誘導(dǎo)方法與植物體細(xì) 胞雜交不同的是用滅活的病毒誘導(dǎo)。動物體細(xì)胞培養(yǎng) 需要滿足以下條件：無菌無毒的環(huán)境、營養(yǎng)、溫度和 pH以及氣體環(huán)境。氣體環(huán)境必須是含 95%的空氣加5%的 CO2， O2是細(xì)胞代謝所必需的， CO2是維持培養(yǎng)液的 pH。在使用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)動物細(xì)胞時，由于人們對一些細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此通常需加入血清、血漿等一些天然成分。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，用到的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶。 生物種類 植物細(xì)胞 動物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 常用方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射技術(shù) Ca2+處理法 受體細(xì)胞 體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 轉(zhuǎn)化過程 將目的基因插 入到 Ti質(zhì)粒的 TDNA上 → 農(nóng) 桿菌 → 導(dǎo)入植 物細(xì)胞 → 整合 到受體細(xì)胞的DNA→ 表達(dá) 將含有目的基因的表達(dá)載體提純→ 取卵（受精卵）→ 顯微注射 → 受精卵發(fā)育 → 獲得具有新性狀的動物 Ca2+處理細(xì)胞→ 感受態(tài)細(xì)胞→ 重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 → 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 項目 動物細(xì)胞融合 植物體細(xì)胞雜交 原理 細(xì)胞膜的流動性 細(xì)胞膜的流動性及 細(xì)胞的全能性 誘導(dǎo)手段 除物理、化學(xué)方法外還可用滅活的病毒 物理、化學(xué)方法 酶 胰蛋白酶或膠原蛋 白酶 纖維素酶和果膠酶 結(jié)果 雜種細(xì)胞群 雜種植株 應(yīng)用 制備單克隆抗體等 培育白菜 —甘藍(lán)等 一、選擇題 ，因此無法用細(xì)胞 培養(yǎng)的方法生產(chǎn)疫苗。自 1979年乙肝病毒基因組的 DNA測序完成后，已知病毒的核心蛋白和表面抗原 蛋白的氨基酸序列。如圖所示是應(yīng)用生物工程技術(shù)生 產(chǎn)乙肝疫苗的示意圖，下列相關(guān)敘述中不正確的是 （ ） ②過程中需要限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶 解析 基因工程能定向地改造生物的遺傳性狀，題中將乙肝病毒的有關(guān)基因引入細(xì)菌，從而達(dá)到定向改造細(xì)菌的目的；乙肝病毒起抗原作用的是其表面抗原蛋白，所以生產(chǎn)乙肝疫苗的目的基因是編碼表面抗原蛋白的基因，而不是編碼核心蛋白的基因；圖中②是將目的基因與載體連接，并將重組 DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞中的過程，此過程需要限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶。 答案 B 2.（ 09浙江金華十校期末）為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。以下說法不正確的是 （ ） ，構(gòu)建重組 DNA分子需要限制 性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶 DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常