重組dna-分子克隆技術(shù)(已修改)
2025-02-02 16:12 本頁面
【正文】 重組 DNA技術(shù) Rebinant DNA Techniques 主要內(nèi)容 ? 基本知識 ? 實(shí)驗(yàn)流程 ? 實(shí)驗(yàn)操作 ? 相關(guān)問題 第 1部分：基本知識 ? 克隆與克隆化 克?。?指同一副本或拷貝的集合 克隆化： 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化。 分子克?。?為某一研究目的，從眾多不同的分子群體中分離的某一感興趣分子，繼而經(jīng)無性繁殖（擴(kuò)增）產(chǎn)生的很多相同分子的集合。 ? DNA克隆 DNA克隆就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體 DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 ,篩選出含有目的基因轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一 DNA分子，即 DNA克隆又稱重組 DNA。 ? 基因重組 (gene rebination) 是指 DNA片段胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。 ? 基因工程 (geic engineering） 是指采用人工方法將不同來源的 DNA進(jìn)行重組，并將重組后的 DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程。 又稱為重組 DNA技術(shù) (rebinant DNA technology)。 ? 相關(guān)酶類 （ 1）限制性內(nèi)切酶： 識別特異序列，切割 DNA （ 2） DNA連接酶： 催化 DNA中相鄰的 5′ 磷酸基 與 3′ 羥基間形成磷酸二酯鍵，使 DNA切口 封合，連接 DNA片段 （ 3） DNA聚合酶 Ⅰ ： cDNA中第二條鏈。 。 。 3′ 末端。 （ 4） Taq酶： 催化 PCR反應(yīng)，聚合 DNA （ 5）反轉(zhuǎn)錄酶： cDNA。 DNA聚合酶 Ⅰ 進(jìn)行填補(bǔ) （ 6）多聚核苷酸激酶： 催化 DNA 5′ 羥基末端 磷酸化，或標(biāo)記探針 （ 7）堿性磷酸酶： 切除 DNA5′ 末端磷酸基 （ 8）末端轉(zhuǎn)移酶： 在 3′ 羥基末端進(jìn)行同系多 聚核苷酸加尾。 （ 9） DNA酶： 切割 DNA （ 10） RNA酶： 切割 RNA ? 目的基因 有時(shí)應(yīng)用重組 DNA技術(shù)分離、獲得某一感興趣的基因或DNA序列，有時(shí)是為獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物 —— 蛋白質(zhì)。 目的 DNA有兩種類型： cDNA和基因組 DNA。 cDNA是指在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與 RNA（通常指 mRNA）互補(bǔ)的單鏈 DNA，經(jīng)聚合反應(yīng)，單鏈 cDNA進(jìn)而合成雙鏈cDNA。 基因組 DNA是指包含一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有 DNA序列。 ? 載體： 是指為“攜帶”感興趣的外源 DNA,實(shí)現(xiàn)外源 DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用 的一些 DNA分子，是運(yùn)載外源 DNA有效進(jìn)入受體 細(xì)胞內(nèi)的工具?？煞譃榭寺≥d體和表達(dá)載體。 ? 克隆載體的條件： ① 有某種限制酶的一個切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶 的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個； ② 外源 DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我 復(fù)制，載體應(yīng)對受體細(xì)胞無害，以及載體能接納盡 可能大的外源 DNA片段； ③ 有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便知道外源 DNA 已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出； ④ 具有促進(jìn)外源 DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。 多克隆位點(diǎn) ori 復(fù)制起始點(diǎn) 遺傳標(biāo)記 Amp polylinker 基因載體 ? 表達(dá)載體 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體。 ? 表達(dá)載體的條件 ① 轉(zhuǎn)錄的啟動子和終止子 ② 核糖體結(jié)合位點(diǎn) ③ 基因拷貝數(shù) ④ 宿主細(xì)胞的翻譯效率
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