重組dna技術(shù)1(已修改)
2024-12-03 23:21 本頁(yè)面
【正文】 11 重組 DNA技術(shù) 重組 DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù) 獲得需要的目的基因 （ 外源基因 ） 構(gòu)建重組質(zhì)粒和基因克隆 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化子的篩選 轉(zhuǎn)化子的分析 —— Southern雜交 重組 DNA技術(shù) ， 又稱為 基因克隆 或 分子克隆技術(shù) ， ? 克隆 (clone)無(wú)性繁殖 ? 分子克隆 – DNA的無(wú)性繁殖技術(shù) ? 重組 DNA技術(shù) 包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟 。 ? 重組 DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起 ， 并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè) 。 重組 DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù) 基因工程 (geic engineering) ?所謂 基因工程 (geic engineering)就是 把外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi) ， 使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 ， 轉(zhuǎn)錄 ， 翻譯表達(dá)的操作叫基因工程 。 ?基因工程可使另一種生物獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物 。 ? 重組 DNA操作 一般步驟： （ 1）獲得目的基因； （ 2）與克隆載體連接，形成新的重組 DNA分子； （ 3）用重組 DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳； （ 4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定； （ 5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 ?獲得需要的目的基因常用的方法： （ 1） 直接從生物體中 提取總 DNA， 構(gòu)建基因組 DNA文庫(kù)(genomic DNA library)， 從中調(diào)用目的基因； （ 2） 以 mRNA為模板 ， 反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA片段 ， 建立cDNA文庫(kù)； （ 3） 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR） 特異性地?cái)U(kuò)增 所需要的目的基因片段 ， 等等 。 （ 4） 化學(xué)合成 獲得需要的目的基因（外源基因） ? 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取分離與基因組文庫(kù)的構(gòu)建 ? 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取分離程序 苯酚沉淀蛋白質(zhì) ? 紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA溶液的純度和濃度 。 ? 基因組 DNA文庫(kù)的構(gòu)建 將總 DNA經(jīng)過(guò)酶解 ， 經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長(zhǎng)短的 DNA片段 。 包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上 ， 轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫(kù) 。 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 mRNA 反轉(zhuǎn)錄 cDNA (互補(bǔ) DNA） 第二條 DNA鏈 ? 反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ) DNA, cDNA ? 構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題 —— 費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列 ? 反轉(zhuǎn)錄人工合成 互補(bǔ) DNA方法的優(yōu)勢(shì) —— 獲取的 DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR） ? PCR技術(shù)就是在體外中通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。
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