重組dna技術(shù)1-文庫吧
2025-10-14 23:21 本頁面
【正文】 ? 加入 4種物質(zhì) ： （ 1） 作為模板的 DNA序列； （ 2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自 5’端序列相互補(bǔ)的DNA引物（ 20個(gè)左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） TaqDNA聚合酶； （ 4） dNTP（ dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR） ?變性、退火、延伸三步曲 ?變性 ： 雙鏈 DNA解鏈成為單鏈 DNA ?退火 ： 部分引物與模板的單鏈 DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 ?延伸 ： 以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新 DNA鏈 ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ PCR） ?每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍 ?30輪循環(huán)可獲得 —— 230（ 109)個(gè)基因片段 PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ) ? PCR技術(shù)的發(fā)明 ? PCR的發(fā)明是 DNA操作技術(shù)的革命 ? 美國 Mullis教授 開汽車時(shí)的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路 —— DNA雙螺旋 行駛的汽車 —— 一小段 DNA引物 …… 1988年發(fā)明了 PCR技術(shù) 1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng) ? 基因重組和克隆操作最重要的工具是： 和 主菌 ? 微量的目的基因必須經(jīng)過基因克隆獲得大量的拷貝后 ， 才能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的重組 、 轉(zhuǎn)化和表達(dá)等操作 。 構(gòu)建重組質(zhì)粒 DNA和基因克隆 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 限制性內(nèi)切酶 是從細(xì)菌中分離提純的 核酸內(nèi)切酶 ，可以識(shí)別并切開核酸序列特定位點(diǎn) —— 分子手術(shù)刀 ? Arber、 Smith和 Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了 1978年的諾貝爾獎(jiǎng) 。 分子刀 DNA限制性內(nèi)切酶 識(shí)別特定的核苷酸序列 4~6個(gè)堿基對(duì) 形成粘性末端或平端 重組 DNA的操作 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了 200多種 ? EcoRI特異識(shí)別GAATTC及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段 ? 粘性末端 ? T4連接酶 基因體外重組 The formation of a rebinant DNA molecule 載體 載體是運(yùn)送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具 ， （ 1） 能夠 自我復(fù)制 ， 并帶動(dòng)插入的外源基因一起復(fù)制 （ 2） 具有合適的 限制性酶切位點(diǎn) （ 3） 具有合適的 篩選標(biāo)記 （ 4） 細(xì)胞內(nèi) 拷貝數(shù)要多 （ 5） 載體的 分子量要小 （ 6） 細(xì)胞內(nèi) 穩(wěn)定性高 目前最常用的載體包括 細(xì)菌質(zhì)粒 、 l噬菌體 、 cosmid質(zhì)粒等 。 ? 質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀 DNA分子 。 進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個(gè)質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù) 。 質(zhì)粒
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