dna-酶切、回收和連接(已修改)
2025-08-16 17:39 本頁面
【正文】 實(shí)驗(yàn)七 基因片段的亞克隆 (DNA的酶切、回收和連接 ） 一 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康? DNA酶切的基本原理 。 使用方法 。 DNA片段膠回收的方法 二 .實(shí)驗(yàn)原理 類專一識(shí)別雙鏈 DNA中特定堿基序列的核酸水解酶 ， 它們的功能類似于高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng) ， 用于抗擊外來 DNA的侵襲 。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾百種限制性內(nèi)切酶 ， 它們以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵 ， 產(chǎn)生的 DNA片段 5’端為 P， 3’端為 OH。 由于限制性內(nèi)切酶能識(shí)別 DNA特異序列并進(jìn)行切割 ，因而在基因重組 、 DNA序列分析 、 基因組甲基化分析 、 基因物理圖譜繪制及分子克隆等技術(shù)中收到廣泛應(yīng)用 。 分子生物學(xué)中經(jīng)常使用的是 II型限制性內(nèi)切酶 。它能識(shí)別雙鏈 DNA分子中特定的靶序列 （ 4～8bp),并在該序列內(nèi)切斷 DNA， 形成特有的粘末端或平端 。 3. DNA的連接 在 T4DNA連接酶的作用下 ， 平端或帶有相同粘末端的 DNA分子可以連接上 。 DNA連接酶的作分三步： ① T4DNA 連接酶與輔助因子 ATP形成酶 AMP復(fù)合物 。 ② 酶 AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有 5’磷酸基和 3’羥基切口的 DNA分子上 ， 使 DNA腺苷化 。 ③ 產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵 ， 把缺口封起來 。 三 . 試劑與器材 〈 一 〉 試劑 1. 限制性內(nèi)切酶 EcoRI, HindIII ； 10 內(nèi)切酶緩沖液 2. T4DNA連接酶； 10 連接酶緩沖液 3. 電泳緩沖液 （ TBE或 1 TAE） 4. 瓊脂糖；溴酚蘭；溴化乙錠 (工作濃度 ) 5. 酚；
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