ecoli感受態(tài)細胞的制備、質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)化、提取與酶切鑒定(已修改)
2025-01-17 02:56 本頁面
【正文】 實驗 54 感受態(tài)細胞的制備 、 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 、 提取與酶切鑒定 制作人：劉如石 一 . 實驗目的和要求 通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化受體菌細胞的原理與技術； 了解質(zhì)粒 DNA的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細胞中分離、提取質(zhì)粒 DNA的方法； 掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法； 通過本實驗了解大腸桿菌感受態(tài)細胞制備、 DNA轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學研究中的意義與作用。 二 .實驗原理 感受態(tài)細胞制備 :所謂 感受態(tài) 是指受體細胞處于容易吸收外源 DNA的一種生理狀態(tài) ， 可以通過物理與化學方法誘導形成 ， 也可以自然形成 ， 在基因工程技術中通常采用誘導的方法 。 用于轉(zhuǎn)化的受體菌細胞一般是 限制 修飾系統(tǒng) （ RestrictionModification） 缺陷的變異株 ， 以防止對導入的外源 DNA的切割 ， 用符號 RM表示 。 其基本原理是：細菌處于 0℃ 的 CaCl2低滲溶液中 ， 會膨脹成球形 ， 細胞膜的通透性發(fā)生變化 ， 轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒 DNA形成抗 DNase的羥基 鈣磷酸復合物黏附于細胞表面 ， 經(jīng) 過 42℃ 短時間的熱激處理 ， 促進細胞吸收 DNA復合物 ，在豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后 ， 球狀細胞復原并分裂增殖 ， 在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的 轉(zhuǎn)化子 。 堿裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA：堿裂解法是基于線性大分子染色體 DNA與小分子環(huán)形質(zhì)粒 DNA的變性復性的差異達到分離目的的 ， 在 ～ 環(huán)境中 ， 線型染色體 DNA和環(huán)型質(zhì)粒 DNA氫鍵會發(fā)生斷裂 ， 雙鏈解開而變性 ， 但質(zhì)粒 DNA由于其閉合環(huán)型結(jié)構(gòu) ， 氫鍵僅發(fā)生部分斷裂 ， 而且其互補鏈不完全分離；當將 pH值調(diào)節(jié)到中性并在高鹽濃度下 ， 已分開的染色體 DNA互補鏈不能復性而交聯(lián)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ， 通過離心 ， 大部分染色體 DNA、 不穩(wěn)定的大分子 RNA和蛋白質(zhì) SDS復合物等一起沉淀下來而被除去，而部分變性的閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA在中性條件下很快復性，恢復到原來的構(gòu)型，呈可溶性狀態(tài)保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質(zhì)粒 DNA。 限制性內(nèi)切酶： 又稱為內(nèi)切酶或限制酶，是一類能識別雙鏈 DNA分子特異性核酸序列的 DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。 根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 III型三大類， Ⅰ 類和 III類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有 甲基化作用 及依賴 ATP的限制性內(nèi)切酶活性 。 Ⅰ 類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，但卻隨機地切割回轉(zhuǎn)到被結(jié)合 處的 DNA。 Ⅲ 類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故 Ⅰ 類和 Ⅲ 限制酶在基因工程中基本不用， II類酶在分子克隆中使用廣泛，其基本特點如下： (1)、專一性地識別并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I識別與切割序列為 5`GAATTC3`
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