質(zhì)粒dna提取純化與驗(yàn)證(已修改)
2025-07-01 05:09 本頁面
【正文】 .. . . ..【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆諌A變性提取質(zhì)粒DNA法的原理、過程及各種試劑的作用。掌握凝膠電泳對(duì)DNA分離純化的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】提取、純化質(zhì)粒DNA（堿變性提取法）提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價(jià)閉合環(huán)狀形式存在。細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12．0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用pH值4．6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚／氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳電泳（electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會(huì)向相反的電極移動(dòng)。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會(huì)發(fā)生移動(dòng)，移動(dòng)的速度可因電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動(dòng)速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20 Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對(duì)分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個(gè)因素：1)樣品DNA分子的大小：電泳時(shí)，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量(所含堿基)的對(duì)數(shù)值成反比，這是因?yàn)榇蠓肿佑懈蟮哪Σ磷枇Α?)DNA分子的構(gòu)象：相對(duì)分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA(1iner DNA，L DNA)分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。3)瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA
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