浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定(已修改)
2025-01-28 05:50 本頁面
【正文】 質(zhì)粒 DNA的提取與酶切鑒定 （一）質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?質(zhì)粒簡介 ? 質(zhì)粒是一種寄生性的自主復(fù)制子 ， 存在于細(xì)菌等細(xì)胞中 ， 為雙鏈閉環(huán)的 DNA分子 ， 大小為 1kb~200kb之間 ， 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的能力 ， 但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要利用宿主細(xì)胞 （ 細(xì)菌 ） 編碼的一些酶和蛋白質(zhì) 。 ?分離純化質(zhì)粒的原理 ? 分離純化質(zhì)粒 DNA主要是利用宿主細(xì)菌 DNA與質(zhì)粒DNA之間的差異來進(jìn)行的 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 細(xì)菌 DNA與質(zhì)粒 DNA形狀上均為雙鏈環(huán)形 ， 但二者的分子量相差較大 ， 細(xì)菌 DNA的分子量在 109D左右 ， 而質(zhì)粒 DNA的分子量僅為 106 ~107D， ? 提取純化質(zhì)粒的過程中 ， 細(xì)菌 DNA大多斷裂成線狀分子 ， 而質(zhì)粒 DNA則多數(shù)仍為雙鏈環(huán)狀 ， 從而即可將二者分開 。 ? 本試驗(yàn)采用微量堿變性法來分離純化質(zhì)粒 DNA，具體的分離純化原理如下： 0 細(xì)菌 （含質(zhì)粒） 溶菌酶 （震蕩） 破細(xì)胞壁 SDS NaOH （ 細(xì)菌 DNA和質(zhì)粒DNA均通過堿變性成為線狀分子 ） 破細(xì)胞膜 冰醋酸 細(xì)菌 DNA與變性蛋白和細(xì)胞碎片纏 繞在一起（不能復(fù)性） 質(zhì)粒 DNA經(jīng)復(fù)性后變?yōu)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀 離心 沉淀：細(xì)菌 DNA、細(xì)胞碎片等 上清：質(zhì)粒 DNA、 RNA、可溶性蛋白等 酚：氯仿 離心 下層：酚，氯仿 中層：變性蛋白 上清（水層）：質(zhì)粒 DNA、 RNA等 無水乙醇 離心 上清：可溶性雜質(zhì)等 沉淀：質(zhì)粒 DNA、 RNA等 RNase 質(zhì)粒 DNA （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒 DNA的天然結(jié)構(gòu)為共價(jià)閉環(huán) （ 超螺旋 ） 結(jié)構(gòu) ，但在制備過程中 ， 由于各種因素的影響 ， 同一質(zhì)粒 DNA的分子可能呈現(xiàn)出如下幾種構(gòu)型： ? ① 超螺旋型 （ 共價(jià)閉環(huán) ） 質(zhì)粒 DNA： （ cccDNA）超螺旋狀 。 ? ② 開環(huán)質(zhì)粒 DNA： （ ocDNA） 質(zhì)粒 DNA的兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 ， 從而形成松弛的環(huán)狀分子 。 ? ③ 線狀質(zhì)粒 DNA： （ linearDNA） 質(zhì)粒 DNA的兩條鏈在同一處斷裂 ， 從而變?yōu)榫€狀分子 。 見 圖 1 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 電泳時(shí) ， 由于分子形狀的不同 ， 三種質(zhì)粒 DNA的泳動(dòng)行為不同 ， 根據(jù)電泳遷移率從小到大的順序分別為開環(huán)質(zhì)粒 DNA、 線狀質(zhì)粒 DNA和超螺旋質(zhì)粒 DNA。 ? DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定原理 ? 核酸是一種兩性電解質(zhì) （ 堿基 、 磷酸 ） ， 在 ， 核酸帶負(fù)電荷 ， 電泳時(shí)向正極移動(dòng) ，根據(jù)核酸分子所帶電荷的多少 ， 分子的大小及構(gòu)型的差異 ， 可用電泳的方法對核酸進(jìn)行分離和鑒定 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 電泳中所使用的支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠 ， 核酸中常用瓊脂糖凝膠 。 ? 不同
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