浙江大學生物化學實驗甲奧賽質粒dna的小批量提取與酶切鑒定(編輯修改稿)
2025-02-12 05:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 、 質粒 DNA的酶切鑒定 BamHⅠ ： G G A T C C HindⅢ ： A A G C T T C C T A G G T T C G A A ? 兩條鏈的斷裂位置是交錯地擔又對稱地圍繞著一個對稱軸排列 。 ? ⑵ 、 產(chǎn)生平末端的酶： HaeⅢ ： G G C C C C G G ? 兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱結構的中心 。 常用限制性內(nèi)切酶的酶切位點可參見有關書藉 。 （ 二 ） 、 質粒 DNA的酶切鑒定 ? 限制性內(nèi)切酶由于能識別特異順序并進行切割 ，因而在基因重組 、 序列分析 、 基因組甲基化分析及基因物理圖譜的繪制等技術中被廣泛應用 。 ?重組質粒 pBSKS的酶切圖譜 ? 重組質粒 pBSKS 的酶切圖譜見 圖 。 ?⑴ 、 由圖可見 ， 實驗所用的 BamHⅠ 和 HindⅢ 在質粒 pBSKS 上均為單切點的限制性內(nèi)切酶 ， ?⑵ 、 pBSKS 經(jīng)這兩種酶切割后可產(chǎn)生大小二片段 ， 大片段為 2. 96kb， 小片段為 。 （ 二 ） 、 質粒 DNA的酶切鑒定 ? 如為完全酶切 ， 電泳后應產(chǎn)生這兩個片段的電泳圖譜 ， 由此即可對提取的質粒進行鑒定 。 ? 操作方法 ?（ 1） 、 酶切反應體系 試劑 體積（ ul） ddH2O 10 10 buffer 2 質粒 6 （約 1~5ug) BamHⅠ 1（約 10U） HindⅢ 1（約 10U） 總體積 20 （ 二 ） 、 質粒 DNA的酶切鑒定 ? 加樣順序：水 緩沖液 DNA酶，酶總是最后才加入到反應體系中。 ? 各組分加完后可輕彈管壁，使混合均勻，并用離心機短暫離心至管底。切忌振蕩混勻！ ?（ 2）、酶切條件 ? 將離心管置于 37℃ 保溫 2h，使酶切完全，備用。 ?（ 3） 、 電泳鑒定 ? 膠濃度： ~% ? 上樣量： 10ul質粒 +2ul上樣緩沖液 ? 各步操作方法及注意事項解說詳見 P148 P149 。 （ 二 ） 、 質粒 DNA的酶切鑒定 ?實驗結果及處理 ? 仔細觀察電泳后熒光帶的顯示情況，據(jù)此繪制電泳圖譜并對圖譜進行簡要說明。 ? 注意與未經(jīng)酶切的質粒的電泳圖譜相比較。 （二）、質粒 DNA的酶切鑒定 ?單酶切反應標準體系的建立 ? 在建立酶切反應體系時主要需考慮兩個關鍵因素：加入的 DNA量 和酶量。 ? 根據(jù)定義，在 50 μl體系中， 1 單位的限制性內(nèi)切酶即可在 60 分鐘內(nèi)完全切割 1 μg 的底物 DNA。 ? 但是，目前大多使用 5－ 10 倍量的過量酶來切割DNA，以利于克服由于 DNA 來源不同、質量和純度不同而造成的實驗失敗。 ?一般的反應體系如下： （二）、質粒 DNA的酶切鑒定 ?反應條件 ? 反應時間： 1~2小時，一般 。 ? 可加
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