【文章內(nèi)容簡介】 棄去 )，加入 95%乙醇， DNA即沉淀析出。離心，棄去上清液，沉淀 (粗 DNA）。操作步驟 重復(fù)處理一次。 （ 5）將上步得沉淀溶于 ，然后以線狀徐徐加入 2倍 95%乙醇，邊加邊攪， 取出絲狀 DNA，依次用 70%、80%、 95%及無水乙醇各洗一次，真空干燥。 鑒定：用二苯胺法測定 DNA 實驗五 血液中葡萄糖的測定 【 實驗?zāi)康?】 （ 1）理解血糖在生物體內(nèi)的重要意義。 （ 2）掌握 FolinWu法測定血糖含量的原理和方法。 【 實驗原理 】 葡萄糖是血液主要的糖類，因此測血糖含量就是測血液中葡萄糖的含量。測定血液中葡萄糖的含量，即測復(fù)雜組分中一種物質(zhì)的量，根據(jù)生化實驗基本技術(shù)的原理，可采用分光光度法（比色法）進行測定。 血液中的葡萄糖與堿性硫酸銅溶液共熱，銅離子即被血液中的葡萄糖還原成氧化亞銅，后者又可使鉬酸試劑還原成低價的鉬藍(lán)（藍(lán)色）。血糖的含量與產(chǎn)生的氧化亞銅成正比，氧化亞銅的量與形成的鉬化合物的量成正比，可以用比色的方法進行測定。 【 實驗試劑與器材 】 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 （ 1） 1%（ m/V）葡萄糖母液 稱取葡萄糖 ，溶于蒸餾水中，然后用 100ml容量瓶定容至刻度。 （ 2）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 用移液管吸取 1%葡萄糖母液，放入 100ml容量瓶內(nèi)，然后定容至刻度。 堿性硫酸銅溶液（ A、 B液） （ 1） A液：稱取無水碳酸鈉 ，酒石酸鈉 酸氫鈉 ，用蒸餾水溶解，然后用 1000ml容量瓶定容至刻度。 （ 2） B液：稱取硫酸銅 ，用蒸餾水溶解，然后用100ml容量瓶定容至刻度，加幾滴濃硫酸作為保存劑。 堿性硫酸銅（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 取 A液 25ml， B液 5ml，混合后，再用 A液定容至50ml，搖勻。該混合液在 4℃ 冰箱里可保存數(shù)日，如果暴露于陽光下，數(shù)小時即失效。 酸性鉬酸鹽溶液 稱取鉬酸鈉 ，置燒杯中用蒸餾水溶解，倒入500ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，然后移入另一較大的試劑瓶中，加溴水 ，搖勻，靜置數(shù)小時。置于 1000ml容量瓶中，緩慢加入 85%（ V/V）H3PO4225ml，邊加邊搖勻。再加入 25%（ V/V）硫酸150ml，置暗處至次日，用空氣將剩余的溴趕去，加入冰乙酸 75ml，搖勻，加蒸餾水稀釋至 1000ml，貯存于 棕色瓶中。 10％（ m/V）鎢酸鈉溶液 動物血（家兔心臟取血） 分光光度計 血糖管 奧氏吸管 水浴鍋 1表面皿 【 實驗步驟 】 先在燒杯中加 （草酸鉀或草酸鈉），從家兔心臟取血 10ml放入燒杯，振蕩搖勻。 用奧氏吸管吸取已加抗凝劑的全血 1ml，緩緩放入 20ml錐形瓶中，加水 7ml，搖勻，血液變成紅色透明時加 10％鎢酸鈉 1ml，搖勻，再加 ，隨加隨搖，加完放置 5～ 15min，至沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣?，濾紙過濾。每毫升無蛋白血濾液相當(dāng)于 。 取具 25ml刻度的血糖管 3只，編號，用奧氏吸管吸取無蛋白血濾液 2ml，放入第一只血糖管中，于第二只 血糖管中加 2ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。第三只血糖管中加 2ml蒸餾水。然后各加 2ml新配置的堿性硫酸銅溶液，同時置沸水浴內(nèi)煮 6min，取出，在流水中迅速冷卻，各加入 4ml酸性鉬酸鹽溶液， 1min后以蒸餾水稀釋至25ml，混勻，倒入比色杯，用 722型風(fēng)光光度計于420～ 440nm波長比色（先以空白管調(diào)節(jié)零點，然后測標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管）。 按下式計算 100ml全血中所含的血糖質(zhì)量（ mg）。 m＝ A1 C0247。 A0247。 100 式中： m： 100ml血中所含的糖質(zhì)量 C0：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度 A1：樣品溶液吸光度 A0：標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度 【 注意事項 】 ，所取血液的量必須準(zhǔn)確。如果由吸 管中放出血液的速度太快，會有大量血液粘在吸管內(nèi)壁，容量不準(zhǔn)，所以一般放出 1ml血液所用的時間不應(yīng)少于 1min。 ，是因鎢酸鈉與硫酸作用生成鎢酸，在適當(dāng)酸度時，使血紅蛋白變性、沉淀。如血沉淀放置后不變?yōu)樽丶t色或重濾后仍混濁，可在鎢酸與血混合液中加入 10％硫酸 1～ 2滴，待變?yōu)榘底厣? 再濾。 ，尚有其他還原性物質(zhì)，所以實驗結(jié)果可能偏高 20%～ 30%。 【 思考題 】 1．移液管使用時應(yīng)注意哪些問題 ? 2．全血中除了葡萄糖還有哪些還原性物質(zhì) ? 實驗六 血清中總膽固醇的測定 【 實驗?zāi)康?】 學(xué)習(xí)血清膽固醇的檢測方法 。 【 實驗原理 】 膽固醇及其酯在硫酸存在下與鄰苯二甲醛作用，產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)對 550nm波長的光有最大吸收，可用比色法定量測定。 100ml樣品中膽固醇含量在400mg之內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。 【 實驗試劑與器材 】 鄰苯二甲醛試劑 90%醋酸 混合酸 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇貯液（ 1mg/ml） 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液（ ） 人血清 試管 吸管 容量瓶 燒杯 1電子分析天平 1 722型（或 7220型）分光光度計 【 實驗步驟 】 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取清潔干燥試管 5支，編號，按表加入試劑。 加畢，混勻，靜置 10min，以 550nm波長比色測定，以吸光度值為縱坐標(biāo)，膽固醇含量為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 管號 試劑 0 1 2 3 4 標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液 /ml 0 醋酸 /ml 0 鄰苯二甲醛試劑 /ml 蒸餾水 /ml 混合酸 /ml 100ml樣品中總膽固醇含量 /mg 0 100 200 300 400 A550nm 樣品的測定 取 2支清潔干燥試管，編號后，按表加入試劑。 顯色時要避免高溫，采用混合酸液反應(yīng)時溫度不會升得太高，一般在 4~32℃ 時，顏色能穩(wěn)定 2h。 加畢，混勻，靜置 10min，于 550nm波長比色，以對照管校正零點，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即知 100ml樣品中總膽固醇含量（ mg）。 管號 試劑 對照 樣品 醋酸 /ml 血清 /ml 鄰苯二甲醛試劑 /ml 0 無水乙醇 /ml 0 混合酸 /ml 實驗七 唾液淀粉酶活性的觀察 【 實驗?zāi)康?】 酶是化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)的生物催化劑。其活性受到很多因素的影響，如溫度、 pH值以及抑制劑激活劑等。通過本次的實驗觀察，同學(xué)們應(yīng)該更加深刻的理解理論課上所講的酶促反應(yīng)動力學(xué)的內(nèi)容。 【 實驗原理 】 在本實驗中，以稀釋的唾液作為淀粉酶液。唾液內(nèi)的淀粉酶可將淀粉逐步水解成各種不同大小的糊精分子，最終產(chǎn)物為麥芽糖和少量的葡萄糖。它們遇碘呈不同的顏色。直鏈淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈藍(lán)色；糊精按分子從大到小的順序，遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色和紅色，最小的糊精和麥芽糖遇碘不顯顏色。 淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解： 淀粉 → 紫色糊精 → 紅色糊精 → 麥芽糖及少量葡萄糖 遇 I2分別呈現(xiàn)： 藍(lán)色 → 紫色 → 紅色 → 不顯色 由于在不同溫度，不同 pH，或者在有激活劑或抑制劑存在的條件下唾液淀粉酶的活性高低不同，則淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反應(yīng)混合物遇碘所呈現(xiàn)的顏色來判斷，從而可了解上述諸因素對酶活性的影