【文章內(nèi)容簡介】 H（ e）為受體的指示酶 以 NAD(P)H為輔酶參與的指示酶 觸酶 POD (最常用） P152 2H2O2+4AAP+酚 醌亞胺 (紅色 )+4H2O POD 32 例：葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖 Glu＋ O2＋ H2O GA＋ H2O2 H2O2＋ 4AAP＋酚 H2O＋ O2＋紅色醌類化合物 GOD POD 葡萄糖氧化酶（ glucose oxidase， GOD）利用 O2和 H2O將 Glu氧化成 GA，并釋放 H2O2 ，過氧化物酶（ peroxidase，POD）在色原性氧受體存在時將 H2O2分解為 H2O和 O2 ，并將色原性氧受體 4AAP和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應。紅色醌類化合物的量與 Glu含量成正比。 即 POD催化下， H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此類色素原供氫體包括： OT、 DAB、 ODA、 TMB。 33 2. NAD(P)+或 NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應 許多氧化還原反應，尤其是作為工具酶如 LD、 GLD、G6PD等參與時，常將底物的 H去除后傳遞給 NAD (P)+形成NAD(P)H。借助 NAD(P)H340nm處特征性的光吸收，借此用分光光度法檢測。 如：葡萄糖、尿素、 β羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、 AST、 LD、 GLD、 CK、 ALD、 G6PD、 ICD等。 例： 尿素＋ H2O 2NH3＋ CO2 NH3＋ α酮戊二酸 ＋ NADH＋ H+ 谷氨酸＋ NAD+＋ H2O 尿素酶 GLD P152 P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) + 34 五、血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化 方法 儀器設備 試劑 自動生物化學分析儀參數(shù)設置 標本的采集、運輸與保存 P153 35 標本的采集、運輸與保存 溶血：細胞內(nèi)酶而言，細胞內(nèi)外濃度差異大；所以應及時進行分離， 靜脈采血后應在 1～ 2h內(nèi)分離血清 。 抗凝劑：利用草酸鹽、枸櫞酸鹽、 EDTA抗凝的血漿一般不用作酶活性測定；肝素對 ALT、 AST、 CK、 LD、 ACP檢測均無影響，可用于急診；臨床多用 血清 為首選測定標本。 溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當天測定，否則應放冰箱冷藏； 通常在 0～ 4 176。C下使用、處理及保存 ，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學測定時血清標本及質(zhì)控長期保存的方法。 P155 36 六、酶活性濃度單位 （一）酶活性單位 慣用單位 用首先報告該種酶測定方法的臨床酶學家的名字來命名其單位，即使同一種酶因方法不同而有數(shù)種活性單位，參考值差別很大。 國際單位 1963年， 1IU＝ 1μmol/min （ 25 176。C 及其他最適條件下） 1976年， 1U＝ 1μmol/min（特定條件下） 1979年， 1Katal＝ 1mol/s（規(guī)定條件下）， 1U＝ P156 37 （二）酶活性濃度單位 以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示； 各國學者習慣用 U/L表示體液中酶催化活性濃度， 1U/L=正常上限（ upper limits of normal， ULN）倍數(shù) 把酶測定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)； 易于比較解釋來自不同方法的結(jié)果，利于各實驗室間質(zhì)評調(diào)查； 可將 ULN進一步適當分級，制定出輕度、中度及重度增加的范圍，使檢測結(jié)果更加一目了然； P156 38 （三）酶活性濃度計算 連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度時，使用摩爾消光系數(shù)（ ε）。其定義為：特定條件下，一定波長的光，光徑為 ，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為 。 連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（ ΔA/min） U/L＝ ΔA min V 106 ε v L ΔA— 吸光度變化 106 — 把 mol換算成 μmol v— 樣品量 （ ml） L — 比色杯光徑（ cm） V— 反應體系體積（ ml） ε — 摩爾消光系數(shù)（ cm2 mol1 ） P157 39 自動生物化學分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上講 V， v和 L均為固定值， ε為常數(shù)，則可將公式簡寫為： U/L＝ ΔA min K V 106 ε v L K= K為酶活性濃度定量系數(shù) 主要用于臨床酶活性測定的計算與校正 K值設置應考慮酶的參考值上限及測定時間兩方面，這些均與儀器測定的噪音有關。 P158 40 第 三 節(jié) 酶的免疫化學測定 41 一、報告方式 酶活性濃度單位： U/L 質(zhì)量濃度單位： ng/ml， μg/L 二、優(yōu)點 靈敏度高 特異性高 能用于檢測一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白 特別適用于同工酶的檢測 樣品中其他方法不易測出的少量或痕量酶 不受體液中其它物質(zhì)的影響 酶原或去輔基酶蛋白 P160 42 三、缺點 要制備足夠量多的提純酶作為抗原和具有免疫化學性質(zhì)的抗血清 步驟多，操作繁瑣 測定成本高 P161 43 第 四 節(jié) 同工酶及其亞型測定 44 一、概念 同工酶（ isoenzyme） 同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構象、理化性質(zhì)、生物學性質(zhì)以及器官分布和細胞內(nèi)定位不同的一類酶。 亞型（ isoform） 即指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶，往往在基因編碼產(chǎn)物從細胞內(nèi)釋入血漿時因肽酶作用降解而形成。 P161 45 二、分析方法 臨床同工酶的分析可分為兩步 首先精確地分離出某酶的各同工酶組分 測定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性 P162 46 二、分析方法 （一）電泳法 原理 使用最為廣泛 簡便、快速、分離效果好、不破壞酶的天然構象 可分為：乙酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細管電泳 測定步驟為：區(qū)帶分離、活性顯色和檢測結(jié)果 方法 同工酶氨基酸組成不同（一級結(jié)構不同）， pI不同，電泳遷移率也就不同，電泳可將其分開。 P163 47 顯色染料 偶氮染料 四唑鹽 離子型化合物，易溶于水，難溶于一般的有機試劑，利用其進行的偶合反應，生成不同顏色的偶氮色素進行同工酶譜檢測 受氫體