【文章內(nèi)容簡介】 t end assay） 在反應(yīng)過程中測定兩個時間點(diǎn)的吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計算結(jié)果。 計算公式為： CU=（ 待測吸光度 A2－ 待測吸光度 A1） K 。 68圖 44　 兩點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)曲線 A單試劑兩點(diǎn)終點(diǎn)法 B雙試劑兩點(diǎn)終點(diǎn)法 　　　　 　 69 該法能有效地消除溶血(hemolysis)、 黃疸（ icterus） 和脂濁（ lipoturbid） 等樣品本身光吸收造成的干擾。 圖 45 血紅蛋白、膽紅素和脂濁的光吸收曲線 70（二）二點(diǎn)速率法 （ fixedtime assay） 指在反應(yīng)過程中選擇適當(dāng)兩點(diǎn)（此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度）測定吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值用于結(jié)果計算。 計算公式 CU=(A2A1)K 。71圖 46　兩點(diǎn)速率法反應(yīng)曲線 該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問題。 　　　　　　 72（三） 速率 A法（ continuous monitoring assay） 又稱 連續(xù)監(jiān)測法 （ rate assay）， 是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時，連續(xù)選取時間 吸光度曲線中線性期（各兩點(diǎn)間吸光度差值相等）的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（ ΔA/min） 計算結(jié)果。73圖 47　連續(xù)監(jiān)測法反應(yīng)曲線 A單試劑連續(xù)監(jiān)測法　　　 B雙試劑連續(xù)監(jiān)測法 74酶促反應(yīng)的線性段 δ 1及 δ 5值偏小，而 δ 2＝ δ 3＝ δ 4， 故 A1點(diǎn)至 A4點(diǎn)屬線性段 75連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點(diǎn) 可以確定線性期并計算 ΔA/min ， 根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。 酶活性（ U/L） ＝ ΔA/min 理論（或校準(zhǔn)） K值。 代謝物濃度 CU=ΔA/min 校準(zhǔn) K值。 761．理論 K值　 多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認(rèn)的校準(zhǔn)品可用。根據(jù)酶活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性 (U/L)=ΔA/min將此式中 以 K來表示，即為 理論 K值 可作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。 77采用理論 K值的前提 應(yīng)當(dāng)是樣品和試劑的加量準(zhǔn)確、比色杯光徑準(zhǔn)確、溫度控制精確以及波長準(zhǔn)確等。但事實(shí)上由于各型分析儀在注射器容積步進(jìn)電機(jī)精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差，溫度的影響有時也非常大。 78 由于 摩爾吸光系數(shù) 受比色杯光徑、波長等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實(shí)際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實(shí)際的摩爾吸光系數(shù)，然后來計算理論 K值。 79（ 1） NADH（ NADPH）摩爾吸光系數(shù)的測定 NADH（ NADPH） 沒有標(biāo)準(zhǔn)純制品，而且配成溶液后穩(wěn)定性又較差，不能直接用 NADH 或 NADPH標(biāo)準(zhǔn)液來校正儀器，須通過有 NAD+(NADP+)參與的反應(yīng)途徑。 80v 用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶 (GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與 NADH的生成呈 等摩爾關(guān)系 。葡萄糖有標(biāo)準(zhǔn)純制品。v 根據(jù)公式 A=εbC ， 已知比色杯光徑 b和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度 A后便可計算出 NADH（ NADPH） 的摩爾吸光系數(shù) ε 為 A/bC。 81測定方法 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 1Ommo1/L()， 標(biāo)準(zhǔn)液加入量為 ， 酶試劑加入量為 335μL ， 比色杯光徑為 ， 在 340nm測得吸光度為 ，則實(shí)測NADH摩爾吸光系數(shù) = ＝ 6424，即在此臺分析儀上340nm波長處測得 NADH（ NADPH） 的摩爾吸光系數(shù)為 6424，而理論上 NADH（ NADPH） 的 ε 為 6220。 82（ 2） “ 色素原 ” 酶促產(chǎn)物在 405nm波長摩爾吸光系數(shù)的測定 有許多酶底物為人工合成的 “ 色素原 ” 底物，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物，在 405nm波長具有吸收峰。ALP底物 磷酸對硝基苯酚 (4Nitrophenyl phosphate， 4NPP) 經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對硝基苯酚 (4Nitrophenol， 4NP)GGT底物 γL 谷氨酰對硝基苯胺 (γLGlutamylpnitroanilide )或 γL 谷氨酰 3羥基 對硝基苯胺 (γLGlutamyl3carboxylpnitroan)經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對硝基苯胺 (pNitroaniline， 4NA)或?qū)ο趸?5氨基苯甲酸 (2aminonitrobenzoicacid， ANBA)。 83以對硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)測定為例試劑：① 4NP標(biāo)準(zhǔn)儲存液 (1Ommo1/L)② 4NP 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 (， 以 AMP緩沖液稀釋而成 )③ 底物緩沖液 (l5mmol/L 4NPP配于， 37℃,pH )。84測定 方法 4NP標(biāo)準(zhǔn)液加入量為 5μL ， 底物緩沖液加入量為 350μL ， 波長 405nm， 光徑 ， 溫度 37℃ ，測定得吸光度為 A1； 另用蒸餾水代替 4NP標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法測定其吸光度為 A2， 4NP標(biāo)準(zhǔn)液吸光度 ΔA= A 1 A2， 若測得 ΔA 為 ，則實(shí)測 4NP摩爾吸光系數(shù)＝ 18662 85自動生化分析儀的校準(zhǔn)方法v K因素法：又稱標(biāo)準(zhǔn)化法或線性法，當(dāng)物質(zhì)的濃度與吸光度成正比時選用該法。原理：濃度 =因素 吸光度v 非 線 性法：又稱曲 線擬 合法，或稱為 多點(diǎn)定 標(biāo) 。86校準(zhǔn) K值注意事項　 酶活性校準(zhǔn)品經(jīng)校準(zhǔn)操作后由分析儀自動計算得出。 在進(jìn)行酶學(xué)測定時，如果分析條件的變化如溫度、樣品試劑加量和吸光度檢測偏差可同等程度地影響校準(zhǔn)物和待測樣品，則使用校準(zhǔn)品能進(jìn)行補(bǔ)償。一般來說以使用 校準(zhǔn) K值 為好， 但必須有兩個先決條件： ① 必須使用配套的試劑； ② 必須使用配套的高質(zhì)量的校準(zhǔn)品，該校準(zhǔn)品應(yīng)具有 溯源性。 87（四）透射比濁法 (多點(diǎn)校準(zhǔn) ) 抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成的 免疫復(fù)合物 ，在反應(yīng)液中具有一定的濁度，可由一般分光光度法進(jìn)行 透射比濁 （ transmission turbidimetry） 測定，可用于某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測定。該法須做 多點(diǎn)校準(zhǔn) ，再經(jīng) 非線性回歸 ，求出抗原或抗體的含量。 88二、常用生化檢測項目分析方法舉例 1．終點(diǎn)法檢測　 常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷 Ⅲ 法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍(lán)法）等。 892．二點(diǎn)速率法　 苦味酸法測定肌酐采用此法。 903．連續(xù)監(jiān)測法 對于酶活性測定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測法，如：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、 γ谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如：脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測法。 914．透射比濁法 透射比濁法 可用于測定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項目，多數(shù)屬 免疫比濁法 ，載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗 “ O” 、 類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。 92第三節(jié) 分析參數(shù)