【文章內(nèi)容簡介】 樣品膠 、 濃縮膠及分離膠組成 ， 排列順序依次為上層樣品膠 、 中間濃縮膠 、 下層分離膠 。 ? 樣品膠的作用是防止對流 ， 促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋 。 目前一般不用樣品膠 ， 直接在樣品液中加入等體積 40%蔗糖 ， 同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用 。 ? 濃縮膠是樣品膠的延續(xù) ， 凝膠濃度及 pH值與樣品膠完全相同 ， 其作用是使樣品進(jìn)入分離膠前 ，被濃縮成窄的區(qū)帶 ， 從而提高分離效果 。 ? 分離膠的 T=%%， C=%， 緩沖液為 TrisHCl， 大部分蛋白質(zhì)在此 pH條件下帶負(fù)電荷 。 此膠主要起分子篩作用 。 . 樣品濃縮效應(yīng) ? 凝膠孔徑的不連續(xù)性： ? 上述 3層凝膠中 ， 樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠 。 在 電場作用下 ， 樣品顆粒在大孔膠中泳動(dòng)的阻力小 ， 移動(dòng)速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí) ， 受到的阻力大 ， 移動(dòng)速度減慢 。 因而在兩層凝膠交界處 ， 樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶 。 ? 電位梯度的不連續(xù)性： ? 電泳開始后 ， 快離子的快速移動(dòng)會在其后 形成一個(gè)離子強(qiáng)度很低的低電導(dǎo)區(qū) ， 使局 部電位梯度增高 ， 將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的 區(qū)帶 。 ? 緩沖體系離子成分及 pH值的不連續(xù)性： ? 在三層凝膠中均有 Tris及 HCl。 Tris的作用是維持溶液的電中性及 pH值 ， 是緩沖配對離子 。 HCl在任何 pH溶液中均易解離出 Cl－ ， 在電場中遷移率快 ， 走在最前面稱為 快離子 。 ? 電極緩沖液中 ， 除有 Tris 外還有甘氨酸 ， 其 pI=， 在 電極緩沖液中 ， 易解離出甘氨酸根 ， 而在 中 ， 甘氨酸解離度僅有 %1%， 因而在電場中遷移很慢 ， 稱為慢離子 。 ? 血清中大多數(shù)蛋白質(zhì) pI在 ， 在 正極移動(dòng) ， 遷移率介于快離子與慢離子之間 ， 于是蛋白質(zhì)就在快 、 慢離子形成的界面處 ， 被濃縮成為極窄的區(qū)帶 。 當(dāng)進(jìn)入 ， 甘氨酸解離度增加 ， 其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；因此 Cl－ 及甘氨酸根沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn) 。 蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大 ， 被留在后面 ， 逐漸分成多個(gè)區(qū)帶 。 大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí) ， 受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ， 這就是分子篩效應(yīng) 。 ? 當(dāng)被濃縮的蛋白質(zhì)樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠時(shí) ， pH值和凝膠孔徑突然改變 ， 分離膠的 pH值 Pka值（ ～ ） ， 這樣慢離子的解離度增大 ， 因而它的有效泳動(dòng)率也增加 。 此時(shí)慢離子的有效泳動(dòng)率超過了所有蛋白質(zhì)的有效泳動(dòng)率 。 這樣 ， 高電勢梯度不存在了 ， 各種蛋白質(zhì)僅會由于其分子量或構(gòu)型的不同 ， 在一個(gè)均一的電勢梯度和 pH條件下通過一定孔徑的分離膠時(shí)所受阻滯的程度不同 ， 表現(xiàn)的泳動(dòng)率的不同而被分開 。 ? 這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng) ， 后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出 ， 小分子后流出 。 . 電荷效應(yīng) 蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū) ， 但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同 ， 因而泳動(dòng)率也不同 ， 因此各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)區(qū)帶 。 在進(jìn)入分離膠時(shí) ， 電荷效應(yīng)仍起作用 。 ? 目前 ， PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣 ， 雖然電泳過程中無濃縮效應(yīng) ， 但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離 ， 加之在溫和的 pH條件下 ， 不致使蛋白質(zhì) 、 酶 、 核酸等活性物質(zhì)變性失活 ， 也顯示了它的優(yōu)越性 。 變性 PAGE原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。 ? 所謂 非變性凝膠 ， 即在凝膠中不加變性劑 ， 這種凝膠中 ， 蛋白質(zhì)的遷移率受它的靜電荷與分子大小兩個(gè)因素的影響 。 因此在非變性凝膠中進(jìn)行電泳是不能測得分子量的 。 ? 所謂 變性凝膠 ， 即在凝膠中加入變性劑 ， 如尿素 、 SDS(十二烷基磺酸鈉 )、 巰基乙醇 、 DTT等 。 這些變性劑可以破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) ， 把絕大部分蛋白質(zhì)分離成組成它們的亞基 。同時(shí)在蛋白質(zhì)分子周圍包圍了大量負(fù)電荷 。 這種電荷基本上掩蓋了無變性劑存在時(shí)正常就有的任何電荷 。 蛋白質(zhì)在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數(shù)成直線關(guān)系 。 因此利用變性凝膠進(jìn)行電泳可以測得蛋白質(zhì)的分子量 。 目前應(yīng)用較多的變性劑為 SDS。 變性 PAGE原理 ? SDSPAGE時(shí)，在蛋白質(zhì)溶解液中加入 SDS和疏基乙醇。 ? 巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分成單個(gè)亞單位。 ? SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，并形成復(fù)合物。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們在水溶液中的形狀近似雪茄形的長橢圓棒。 不同蛋白質(zhì) SDS復(fù)合 物的短軸相同 ， 約 nm， 而長軸則與蛋白 質(zhì)的 Mr成正比 。 目前 ， 用 SDSPAGE研究過的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種 ， 均證實(shí)此法測定蛋白質(zhì) Mr的可靠性 。 ? 測定未知蛋白質(zhì) Mr時(shí)，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白及適宜的凝膠濃度，同時(shí)進(jìn)行 SDSPAGE，則可根據(jù)已知 Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率和 Mr的對數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得 Mr。 ? 本方法有儀器設(shè)備簡單，操作方便，樣品用量少 ，耗時(shí)少(僅需一天 )，分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì) Mr測定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng) SDSPAGE分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面 試劑與方法（略） 影響因素 1）蛋白質(zhì)與 SDS的結(jié)合 2）離子強(qiáng)度 3）樣品制備 無沉淀，顆粒 4）樣品中存在阻礙 gel聚合的成分，或易變性成分 5）固定、染色 可能丟失小肽段。 2022/6/1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 70 然而 SDSPAGE也有不足之處 ， 尤其是電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白 、 帶有較大輔基的蛋白 (如 糖蛋白 )及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測出的 Mr不太可靠 。 ? 如組蛋白 F1，本身帶有大量正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷，故用 SDSPAGE測得的 Mr為 35 000， 而用其他方法測定的 Mr僅為 21 000。 ? 因此要確定某種蛋白質(zhì)的 Mr時(shí)，最好用 2種測定方法互相驗(yàn)證。尤其是對一些由亞基或兩種以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于 SDS及巰基乙醇的作用 ，肽鏈間的二硫鍵被打開，解離成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測定結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的 Mr ，還需用其他方法測定分子中肽鏈的數(shù)目。 連續(xù)密度梯度電泳 （ PGPAGE） ? 原理： ? 連續(xù)密度梯度電泳使用的是從上至下的一個(gè)正的線性梯度凝膠，點(diǎn)在凝膠頂部的樣品在電場中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸縮小的方向遷移。隨著電泳的繼續(xù)進(jìn)行，蛋白質(zhì)受到孔徑的阻力越大。 ? 電泳開始時(shí)，樣品在凝膠中的遷移速度主要受到本身的電荷密度和樣品分子的大小的影響。當(dāng)遷移所受到的阻力大到阻以使樣品分子完全停止前進(jìn)時(shí)，那些跑得很慢的低電荷的樣品分子將趕上與它大小相同但具有較高電荷密度的分子并停留下來形成區(qū)帶。 ? 因此在梯度凝膠電泳中， 樣品的最終遷移位置僅取決于分子本身的大小，而與樣品分子的電荷密度無關(guān) 。 樣品混合物中分子質(zhì)量大小不同的組分，電泳之后將依分子質(zhì)量大小停留在不同的凝膠孔徑層次中形成相應(yīng)的區(qū)帶 。 ? 線性梯度凝膠制備 ? 線性梯度凝膠制備不同于均一濃度凝膠制備 ， 應(yīng)預(yù)先配制低濃度膠 （ 2% 或 4%） 貯液置貯液瓶中；高濃度膠（ 16% 或 30%） 貯液置混合瓶中 （ 兩者體積比為 1/1） ，在梯度混合器及蠕動(dòng)泵的協(xié)助下 ， 從下至上灌膠 。 凝膠聚合后 ， 則形成從下到上 、 從濃至稀依次排列的線性梯度凝膠 。 PGPAGE的優(yōu)點(diǎn) ： ? 由于梯度凝膠孔徑的不連續(xù)性，具有使樣品中各個(gè)組分濃縮的作用，稀釋的樣品可以分次上樣，不會影響分離效果 ? 可提供更清晰的蛋白質(zhì)區(qū)帶，用于蛋白質(zhì)純度的鑒定。 ? 可在一個(gè)凝膠板上同時(shí)測定數(shù)個(gè)相對分子質(zhì)量相差很大的蛋白質(zhì)。 ? 可直接測定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，而不被解離為亞基。因此，本法可作為 SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的補(bǔ)充。 ? 盡管本法有上述優(yōu)點(diǎn)，但主要適用于測定球狀蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，對纖維狀蛋白相對分子質(zhì)量的測定誤差較大。 ? 另外，由于相對分子質(zhì)量測定僅僅是在未知蛋白質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)達(dá)到了被限定的凝膠孔徑時(shí)（即完全被阻止遷移時(shí)）才成立，電泳時(shí)要求足夠高的電壓（一般不低于 2022V），否則將得不到預(yù)期的效果。因此，采用 PGPAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量有一定的局限性，需用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 （ IEFPAGE ） ? 原理： ? 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) ， 當(dāng) pH＞ pI時(shí)帶負(fù)電荷 ， 在電場中向正極移動(dòng)；當(dāng) pH＜ pI時(shí)帶正電荷 ， 在電場中向負(fù)極移動(dòng)；當(dāng) pH=pI時(shí)凈電荷為零 ， 在電場中既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng) ， 此時(shí)的 pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) （ pI） 。 ? 聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體 ， 在電場的作用下會自發(fā)形成一個(gè)連續(xù) pH梯度 。 蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離 。 運(yùn)動(dòng)到等電點(diǎn)膠層時(shí)就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處并聚焦成帶 ， 樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)不同 ， 因而在等電聚焦中得到有效的分離 。 在等電聚焦中 ， 利用各蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)的差異 ， 并不利用凝膠的分子篩作用 。 ? 兩性電解質(zhì)載體是 IEFPAGE中最關(guān)鍵的試劑，它直接影響 pH梯度的形成及蛋白質(zhì)的聚焦。載體兩性電解質(zhì)必須具備的條件 ： ? 它的化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物 ， 不干擾被分離物的鑒定 。 ? 它的分子量要小 ， 這樣便于與被分離的物質(zhì)分開 。 ? 具有化學(xué)惰性 ， 不與被分離物質(zhì)反應(yīng) ， 也不能使被分離物質(zhì)變性 。 ? 在等電點(diǎn)處必須具有足夠的緩沖能力 。 ? 在等電點(diǎn)處必須具有足夠高的電導(dǎo) ， 以使一定的電流通過 。 ? pH梯度的形成： ? 兩性電解質(zhì)載體是含有一系列 pK和 pI各自相異卻又相近的脂肪族多氨基多羧基的混合物 。 將其混入到電泳支持物中 ， 開始電泳后 ， 各組分在中性溶液介質(zhì)中都發(fā)生解離 ， 并形成一個(gè)平滑穩(wěn)定的由正極向負(fù)極逐漸上升的pH 梯度 。 ? 在防止對流的情況下 ， 只要有電流存在就可以保持穩(wěn)定的 pH 梯度 ， 因?yàn)榇藭r(shí)由于擴(kuò)散和電移動(dòng)所引起的物質(zhì)移動(dòng)處于動(dòng)態(tài)平衡 。 ? 在此 pH梯度中，各種蛋白質(zhì)遷移到各自的 pI處而得到分離。由此可見，該蛋白質(zhì)在“自然” pH 梯度中，無論處于何種位置均會向其等電點(diǎn)移動(dòng)，并最終停留在該處。 等電聚焦的優(yōu)點(diǎn)是： ? 有很高的分辨率 ， 可將等電點(diǎn)相差 ～ 質(zhì)分開； ? 一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響 ， 隨著時(shí)間和所走距離加長 ，區(qū)帶越走越寬 ， 而電聚焦能抵消擴(kuò)散作用 ， 使區(qū)帶變窄； ? 由于這種電聚焦作用 ， 不管樣品加在什么部位 ， 都可聚焦到其等電點(diǎn)處 ， 很稀的樣品也可進(jìn)行分離； ? 可直接測出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) ， 其精確度可達(dá) 。 ? 缺點(diǎn)： ? 電聚焦要求用無鹽溶液 ， 而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀 ， ? 樣品中的成分必需停留于其等電點(diǎn) ， 不適用于在等電點(diǎn)時(shí)發(fā)生沉淀或變性的蛋白質(zhì) 四 、 蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳 原理： ? 雙向電泳是一種由任意兩個(gè)單向電泳組合而成的 ， 在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳的分離方法 。 ? 經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后 ， 可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息 。 電泳方法： 1） 制樣 抽提要確保將全部蛋白質(zhì)都提出來 。 2） 一般第一向 IEFAGE用超薄水平板 ， 電泳結(jié)束后切取所需泳道用于第二向電泳 ， 或在 1mm內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行第一向 IEFPAGE， 取出膠條用于第二向電泳 。 第一向電泳的方法同 IEFPAGE， 只是制膠時(shí)要加入 2%兩性電解質(zhì)和 6mol/L尿素 。 3） 第二向電泳時(shí) ， 先將 SDSPAG灌在垂直玻璃板之間 ， 上部留2cm左右空間 ， 待聚合后 ， 將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上 ，用載玻片將膠條輕輕壓直 ， 加 3μL 1%溴酚蘭指示劑 ， 用 1%的瓊脂糖 (用電極緩沖液配制 )密封膠條 ， 瓊脂糖凝固后即可電泳 。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時(shí) ， 停止電泳 。 第二向電泳時(shí) ，用梯度混合器將凝膠制成 %15%的濃度梯度 ， 可以提高電泳的分辨率 。 4） 染色脫色 影響因素 1）樣品處理 需除盡鹽、色素、核酸、酚，蛋白質(zhì)需全部提取出來。 2）樣品越新鮮越好 3）染料靈敏度 4）蛋白質(zhì)的含量、酸堿性、最大最小蛋白質(zhì)的分離程度，對難溶蛋白的檢測。 p