浙江大學生物化學實驗甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-文庫吧
2025-01-01 05:50 本頁面
【正文】 濃度的瓊脂糖凝膠可以分離 200bp~50kb的DNA片斷 ， 通過在瓊脂糖溶液中加入低濃度的瑩光染料溴乙錠 （ EB） ， 在紫外光下即可檢測出10ng的 DNA條帶 。 ? 當用瓊脂糖凝膠電泳法檢測質(zhì)粒 DNA樣品時 ， 根據(jù)條帶的位置即可知道質(zhì)粒 DNA的三種構(gòu)型及其比例 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 此外 ， 還可了解質(zhì)粒樣品中的雜質(zhì) ， 如 RNA、 染色體 DNA、 蛋白質(zhì)等的污染程度 。 電泳時如用已知分子量的核酸作對照 ， 還可測定樣品核酸的分子量 。 ? 材料與試劑 ?⑴ 、 試驗材料 ? 本實驗所用質(zhì)粒為重組的 pBSKS質(zhì)粒 。 其中質(zhì)粒pBSKS來源于大腸桿菌 ， 其物理圖譜見 圖 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?經(jīng)在 BamHⅠ 和 HindⅢ 切點間連接上一個大小為 ， 即成為重組的 pBSKS質(zhì)粒 。 見 圖 。 ?⑵ 、 試驗試劑 ? 試驗試劑及使用時的注意事項解說詳見 P144及P147。 ? 標準核酸的分子量見 圖 。 ? 操作步驟 ?⑴ 、 質(zhì)粒的提取 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒提取的操作方法及注意事項解說詳見 P145。 ?⑵ 、 電泳鑒定 ? 膠濃度： ~% ? 上樣量： 5ul質(zhì)粒 +1ul上樣緩沖液 ? 各步操作方法及注意事項解說詳見 P148。 ? 實驗結(jié)果及處理 ? 仔細觀察純化過程中各步試驗現(xiàn)象 。 ? 仔細觀察電泳后熒光帶的顯示情況 ， 據(jù)此繪制電泳圖譜并對圖譜進行簡要說明 。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 限制性內(nèi)切酶簡介 ? 限制性內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶 （ Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease） 是指能辨認雙鏈 DNA分子中的特異堿基序列 ， 并在此序列處以內(nèi)切方式將 DNA雙鏈同時切斷的一類酶 。 ? 根據(jù)它們的作用特點 ， 可將其分為三類： Ⅰ 類和Ⅲ 類酶 ， 在同一種酶分子中兼有切割和修飾 （ 甲基化 ） 作用 ， Ⅰ 類酶由于切割位點隨機 ， Ⅲ 類酶則由于切割位點不對稱 ， 因此這兩類酶的作用都不大 。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? Ⅱ 類酶由兩種酶組成 ， 一種為限制性核酸內(nèi)切酶 ，另一種為獨立的甲基化酶 。 其中 ， 對我們最為有用的是 Ⅱ 類酶中的限制性核酸內(nèi)切酶 。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶廣泛存在于原核生物中 ， 1970年由 ?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近幾百種 (498種 )。 ? 該類酶能識別 DNA分子中的特異序列 ， 并在此序列處切斷 DNA雙鏈 。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的識別序列為 4個 ~6個堿基對 ， 該序列具回文對稱結(jié)構(gòu) ， 且富含 GC。 （ 即旋轉(zhuǎn) 1800后與原來結(jié)構(gòu)相同 ） ， 少數(shù)酶可識別更長的序列或兼并序列 。 ? 限制性內(nèi)切酶切割后的 DNA片斷 ， 有的產(chǎn)生粘性末端 ， 有的產(chǎn)生平末端 。 如： ?⑴ 、 產(chǎn)生粘末端的酶 （ 二 ）
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