浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-文庫(kù)吧
2025-01-01 05:50 本頁(yè)面
【正文】 濃度的瓊脂糖凝膠可以分離 200bp~50kb的DNA片斷 ， 通過在瓊脂糖溶液中加入低濃度的瑩光染料溴乙錠 （ EB） ， 在紫外光下即可檢測(cè)出10ng的 DNA條帶 。 ? 當(dāng)用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)質(zhì)粒 DNA樣品時(shí) ， 根據(jù)條帶的位置即可知道質(zhì)粒 DNA的三種構(gòu)型及其比例 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 此外 ， 還可了解質(zhì)粒樣品中的雜質(zhì) ， 如 RNA、 染色體 DNA、 蛋白質(zhì)等的污染程度 。 電泳時(shí)如用已知分子量的核酸作對(duì)照 ， 還可測(cè)定樣品核酸的分子量 。 ? 材料與試劑 ?⑴ 、 試驗(yàn)材料 ? 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒為重組的 pBSKS質(zhì)粒 。 其中質(zhì)粒pBSKS來源于大腸桿菌 ， 其物理圖譜見 圖 。 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ?經(jīng)在 BamHⅠ 和 HindⅢ 切點(diǎn)間連接上一個(gè)大小為 ， 即成為重組的 pBSKS質(zhì)粒 。 見 圖 。 ?⑵ 、 試驗(yàn)試劑 ? 試驗(yàn)試劑及使用時(shí)的注意事項(xiàng)解說詳見 P144及P147。 ? 標(biāo)準(zhǔn)核酸的分子量見 圖 。 ? 操作步驟 ?⑴ 、 質(zhì)粒的提取 （ 一 ） 質(zhì)粒 DNA的提取與電泳鑒定 ? 質(zhì)粒提取的操作方法及注意事項(xiàng)解說詳見 P145。 ?⑵ 、 電泳鑒定 ? 膠濃度： ~% ? 上樣量： 5ul質(zhì)粒 +1ul上樣緩沖液 ? 各步操作方法及注意事項(xiàng)解說詳見 P148。 ? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及處理 ? 仔細(xì)觀察純化過程中各步試驗(yàn)現(xiàn)象 。 ? 仔細(xì)觀察電泳后熒光帶的顯示情況 ， 據(jù)此繪制電泳圖譜并對(duì)圖譜進(jìn)行簡(jiǎn)要說明 。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 限制性內(nèi)切酶簡(jiǎn)介 ? 限制性內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶 （ Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease） 是指能辨認(rèn)雙鏈 DNA分子中的特異堿基序列 ， 并在此序列處以內(nèi)切方式將 DNA雙鏈同時(shí)切斷的一類酶 。 ? 根據(jù)它們的作用特點(diǎn) ， 可將其分為三類： Ⅰ 類和Ⅲ 類酶 ， 在同一種酶分子中兼有切割和修飾 （ 甲基化 ） 作用 ， Ⅰ 類酶由于切割位點(diǎn)隨機(jī) ， Ⅲ 類酶則由于切割位點(diǎn)不對(duì)稱 ， 因此這兩類酶的作用都不大 。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? Ⅱ 類酶由兩種酶組成 ， 一種為限制性核酸內(nèi)切酶 ，另一種為獨(dú)立的甲基化酶 。 其中 ， 對(duì)我們最為有用的是 Ⅱ 類酶中的限制性核酸內(nèi)切酶 。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶廣泛存在于原核生物中 ， 1970年由 ?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近幾百種 (498種 )。 ? 該類酶能識(shí)別 DNA分子中的特異序列 ， 并在此序列處切斷 DNA雙鏈 。 （ 二 ） 、 質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列為 4個(gè) ~6個(gè)堿基對(duì) ， 該序列具回文對(duì)稱結(jié)構(gòu) ， 且富含 GC。 （ 即旋轉(zhuǎn) 1800后與原來結(jié)構(gòu)相同 ） ， 少數(shù)酶可識(shí)別更長(zhǎng)的序列或兼并序列 。 ? 限制性內(nèi)切酶切割后的 DNA片斷 ， 有的產(chǎn)生粘性末端 ， 有的產(chǎn)生平末端 。 如： ?⑴ 、 產(chǎn)生粘末端的酶 （ 二 ）
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