浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲奧賽質(zhì)粒dna的小批量提取與酶切鑒定-資料下載頁(yè)
2025-01-16 05:50本頁(yè)面
【正文】 在 37℃ 進(jìn)行 ? 但有些酶的最佳反應(yīng)溫度并不是此溫度，如 SmaI，最適反應(yīng)溫度為 30℃ ，故最好根據(jù)所選用的酶確定反應(yīng)溫度。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 當(dāng)采用聯(lián)合酶切進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)尤其要注意選擇的反應(yīng)溫度是否都滿足兩者的要求，如果有一個(gè)酶的最適溫度不符，建議分步酶切。 ?反應(yīng)時(shí)間 ? 常規(guī)酶切反應(yīng)時(shí)間為 ，但可根據(jù)酶切對(duì)象和酶的用量將保溫時(shí)間延長(zhǎng) 2～ 3小時(shí)，有時(shí)甚至可以過(guò)夜。 ? 一般來(lái)說(shuō)，在 DNA量固定的前提下，長(zhǎng)時(shí)間酶切所需的酶量可適當(dāng)減少，所以在大劑量酶切 DNA時(shí)，可以考慮酶切過(guò)夜。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ?雙酶切的解決方法 ? 在 DNA重組實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)用雙酶切（甚至是 3個(gè)酶切鑒定）鑒定重組子或獲得不同粘性末端的DNA片段， ? 應(yīng)注意，如采用兩種限制酶進(jìn)行切割，則必須分別提供各自的最適鹽濃度。 ? 若兩者可用同種緩沖液，則可同時(shí)水解，否則低鹽濃度的限制酶必須先用，待調(diào)節(jié)鹽濃度后，再用高鹽濃度的限制酶水解。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? 也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，將第一個(gè)酶變性除去后再進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。 ? 應(yīng)注意廠商提供的聯(lián)合酶切緩沖液中并不包括所有類型的酶，即使提供了“萬(wàn)能緩沖液”，有些酶的聯(lián)合酶切也不一定能取得比較好的效果。 ? 通用的解決方法有兩種： （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ?（ 1）分步酶切法 ? 即先選擇一個(gè)酶，采用此酶的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行酶切，酶切完全的 DNA進(jìn)行沉淀后再溶解，然后選用第二個(gè)酶進(jìn)行最佳反應(yīng)。 ? 在酶切時(shí)，一般選擇便宜的酶進(jìn)行酶切沉淀，而后再進(jìn)行第二個(gè)酶的酶切反應(yīng)。 ? 此方法通用性較強(qiáng)，聯(lián)合酶切也比較完全，但較耗時(shí)，而且 DNA再沉淀后有部分損失，要求開始時(shí) DNA的投入量要比較高。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ?（ 2） 同步酶切法 ? 取兩種酶的最佳緩沖液各 50％加入到酶切反應(yīng)體系中，并同時(shí)加入兩種酶進(jìn)行反應(yīng)。 ? 特別是對(duì)不同廠商提供的酶進(jìn)行聯(lián)合酶切時(shí)，即可節(jié)約時(shí)間也可取得比較好的酶切效果。 ?酶切失敗的原因及處理辦法 ? 酶切失敗主要表現(xiàn)為兩方面： ?（ 1） 不完全酶切甚至是 DNA基本未發(fā)生酶切。主要原因有： （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? a、緩沖體系不合適，可進(jìn)行重新酶切。 ? b、酶量加入過(guò)少或酶已失活。增加酶量或換用新酶。 ? c、反應(yīng)時(shí)間不夠。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 ? d、 DNA樣品雜質(zhì)含量高，可采用稀釋酶切或?qū)NA樣品重新抽提后酶切。 ?（ 2） DNA被降解（不成帶狀），主要原因是： ? DNA樣品中含有痕量的 DNA酶，建議重新抽提質(zhì)粒除去 DNA酶。 （二）、質(zhì)粒 DNA的酶切鑒定 ? （ 3）、出現(xiàn)多余的帶。主要原因有： ? a、酶量過(guò)多，出現(xiàn)了星號(hào)活力。 ? b、 DNA樣品中有雜 DNA 。 圖 圖 圖 2. 96kb 重組 pBSKS質(zhì)粒() BamHⅠ HindⅢ 圖 圖 圖
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