實驗一二重組質(zhì)粒dna提取、雙酶切鑒定、凝膠電泳、紫外分光法-資料下載頁
2025-05-26 07:01本頁面
【正文】 ；不宜過高，電泳時容易形成帶形的變形。注意混勻。 沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過多的氣泡，拔起時不要過猛帶出樣品。每點(diǎn)一個樣完，吸取 buffer洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強(qiáng)烈建議每點(diǎn)一個樣換一次槍頭。加樣的速度當(dāng)然是越快越好，注意保證質(zhì)量。點(diǎn)樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面兩不要太大，容易導(dǎo)致脫尾和模糊不清。 ，選擇合適的電壓和時間電泳。 膠孔與電極成水平狀態(tài)，防止樣品跑歪。跑膠期間不時回來看看，防止樣品跑出膠等意外發(fā)生。 四、染色成像 步驟 注意事項 如果膠中沒有加入 EB，用。 ，成像 思考題？ ?酶切前后的對比？ 44 M 酶切后 酶切前 點(diǎn)樣孔 細(xì)菌基因組DNA OC 型質(zhì)粒DNA L型質(zhì)粒DNA SC 質(zhì)粒DNA 細(xì)菌RNA 質(zhì)粒電泳圖譜 四、紫外分光光度法檢測 DNA濃度 1 分光光度技術(shù) 概述 分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對其進(jìn)行定性 、 定量分析的實驗技術(shù) 。 47 特點(diǎn) ①靈敏度高：測定下限可達(dá) 10－ 5～ 10－ 6mol/L ② 準(zhǔn)確度高：能夠滿足微量組分的測定要求，相對誤差 2～ 5％（ 1～ 2％） 。 ③ 操作簡便快速 。 ④ 應(yīng)用廣泛。 48 分光光度計的基本部件 光 電 49 2 紫外分光光度法的原理 （氫燈、氘燈） 入射光＝反射光＋分散光＋吸收光＋透過光 用溶劑作為 “ 空白 ” 校正反射光、分散光 入射光（ I0）＝吸收光＋透過光（ It） 50 光吸收基本定律 : LambertBeer定律 D＝ K C L 吸光度 摩爾消光系數(shù) 吸收物質(zhì)的光徑（ cm） 溶液濃度（ mol/L） 分光光度法分析的依據(jù) ： ①物質(zhì)對光是有選擇的吸收，其吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這就是分光光度法 定性 分析的依據(jù)； ②其吸收光譜的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度有關(guān)，這是分光光度法 定量 分析的依據(jù)。 51 吸收池 或稱比色杯、比色皿、比色池，是用來盛裝被測溶液和決定透光液層厚度的器件。 一般由玻璃或石英制成， 注意： a. 與光束垂直； b. 規(guī)格相同； c. 清潔。 52 紫外分光光度法檢測 DNA的原理 原理：核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在 260nm處有特異的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸濃度成正比。 優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、靈敏、樣品可以回收。 缺點(diǎn)：有一定的誤差（原因）；受蛋白類物質(zhì)干擾。 53 產(chǎn)生誤差的原因： ； ； ； 、 pH值的影響； 。 54 3 實驗步驟 1. 用 TE 對待測 DNA樣品按 1:20稀釋 2. TE作為空對照 ,在波長 260nm、 280nm、 310nm處分別測標(biāo)準(zhǔn) DNA樣品的 OD值 3. 根據(jù) OD值計算 DNA濃度 （ ?g/ml） 單鏈 DNA[ssDNA]=33 (OD260－ OD310) 稀釋倍數(shù) 雙鏈 DNA[dsDNA]=50 (OD260－ OD310) 稀釋倍數(shù) 4. DNA的純度鑒定 OD260/ OD280= （ RNA為 2 .0） 可能有 RNA污染 可能有蛋白質(zhì)污染 55
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