實驗二sdspage凝膠電泳-資料下載頁
2025-04-29 05:54本頁面
【正文】 對于這一類蛋白質(zhì)， SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。 15. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是 SDS不純引起 。 常見問題及處理辦法 １．紋理和拖尾現(xiàn)象 由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。 ２． 蛋白帶過寬 ， 與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。 ３．電泳時間比正常要長 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的 pH選擇錯誤。 ４． 指示劑成微笑符號 （指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率 。 ５ .指示劑成微笑符號 （指示劑前沿呈現(xiàn) 向下 的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全． ６ .凝膠時間不對 ． 通常膠在 30min內(nèi)凝聚．如果凝聚得太慢，可能是 TEMED， APS劑不夠或者失效． ? “ 皺眉 ” （兩邊向下中間鼓起） 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡 。 ? “ 鬼帶 ” 如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在 WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT或 Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量 EDTA來阻止還原劑的氧化。 ? ？ 我們在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的 Buffer；降低分離膠的濃度 。 SDSPAGE的優(yōu)點 ? 設(shè)備簡單 ? 快速 ? 分辨率和靈敏度高 ? 特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定 SDSPAGE的缺點 1. 有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，SDSPAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量 。 SDSPAGE的缺點 ? 2. 還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白 F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們在 SDS凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對數(shù)不呈線性關(guān)系。因此，為了測得真實和完整的蛋白質(zhì)分子量，通?？刹捎枚喾N方法進(jìn)行測定和相互驗證。 小技巧 ? 1： 電泳緩沖液的使用： 電泳緩沖液是完全可以回收再用的，但前提是每次的內(nèi)層緩沖液必須是新配的。每次在電泳完成后內(nèi)外層緩沖液一起回收到一個瓶里，作為下次的外層緩沖液使用。就是配制新的緩沖液只作為內(nèi)層使用（配制 1L可以用很久的），每次都用回收的緩沖液作外層，效果一點都不差，即節(jié)省了試劑，又節(jié)省了時間。 2： 電泳條件的選則 電泳不采用先低壓再高壓的常用方法，每次都是上樣后直接采用 200V恒壓電泳，一般Bio－ Rad的膠板， 39min即可跑到頭，電泳結(jié)果一點都沒有影響。 ?3： 染色與脫色 分子克隆上介紹的方法耗時太長，現(xiàn)在用 Crystal的方法已經(jīng)相當(dāng)快了，稍做改動：染色時加入染液后，在微波爐中煮沸一次即可，切記不要噴了，這個過程大約20～ 30秒，在搖床上染色，這時可以去處理膠板，電泳槽，臺面，待收拾干凈后染色也就結(jié)束了（不要覺得染色時間太短了，已經(jīng)足夠了，太長了脫色也麻煩），此過程大約需要 3～ 5min；回收染液，用自來水清洗幾次膠，再加入適量自來水，放入微波爐中煮沸，條件與染色時一致，搖床脫色，此時你就可以做其他試驗了， 3～ 5min后可以再換一次清水，煮沸脫色，我的經(jīng)驗是一次用水脫色就可以看到 Marker條帶了，兩次以后就可以清析的看到你的結(jié)果了，如果覺得結(jié)果不錯可以留存?zhèn)溆?，再加入脫色液，脫干凈了就行了?
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