實(shí)驗(yàn)二sdspage凝膠電泳(參考版)
2025-05-02 05:54本頁(yè)面
【正文】 ?3： 染色與脫色 分子克隆上介紹的方法耗時(shí)太長(zhǎng)，現(xiàn)在用 Crystal的方法已經(jīng)相當(dāng)快了，稍做改動(dòng)：染色時(shí)加入染液后，在微波爐中煮沸一次即可，切記不要噴了，這個(gè)過(guò)程大約20～ 30秒，在搖床上染色，這時(shí)可以去處理膠板，電泳槽，臺(tái)面，待收拾干凈后染色也就結(jié)束了（不要覺(jué)得染色時(shí)間太短了，已經(jīng)足夠了，太長(zhǎng)了脫色也麻煩），此過(guò)程大約需要 3～ 5min；回收染液，用自來(lái)水清洗幾次膠，再加入適量自來(lái)水，放入微波爐中煮沸，條件與染色時(shí)一致，搖床脫色，此時(shí)你就可以做其他試驗(yàn)了， 3～ 5min后可以再換一次清水，煮沸脫色，我的經(jīng)驗(yàn)是一次用水脫色就可以看到 Marker條帶了，兩次以后就可以清析的看到你的結(jié)果了，如果覺(jué)得結(jié)果不錯(cuò)可以留存?zhèn)溆?，再加入脫色液，脫干凈了就行了。就是配制新的緩沖液只作為內(nèi)層使用（配制 1L可以用很久的），每次都用回收的緩沖液作外層，效果一點(diǎn)都不差，即節(jié)省了試劑，又節(jié)省了時(shí)間。 小技巧 ? 1： 電泳緩沖液的使用： 電泳緩沖液是完全可以回收再用的，但前提是每次的內(nèi)層緩沖液必須是新配的。 SDSPAGE的缺點(diǎn) ? 2. 還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白 F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們?cè)?SDS凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)不呈線性關(guān)系。 SDSPAGE的優(yōu)點(diǎn) ? 設(shè)備簡(jiǎn)單 ? 快速 ? 分辨率和靈敏度高 ? 特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測(cè)定 SDSPAGE的缺點(diǎn) 1. 有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們?cè)谧冃詣┖蛷?qiáng)還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT或 Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量 EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。 ? “ 鬼帶 ” 如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。 ５ .指示劑成微笑符號(hào) （指示劑前沿呈現(xiàn) 向下 的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全． ６ .凝膠時(shí)間不對(duì) ． 通常膠在 30min內(nèi)凝聚．如果凝聚得太慢，可能是 TEMED， APS劑不夠或者失效． ? “ 皺眉 ” （兩邊向下中間鼓起） 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 ３．電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng) 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的 pH選擇錯(cuò)誤。 常見(jiàn)問(wèn)題及處理辦法 １．紋理和拖尾現(xiàn)象 由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。因此，對(duì)于這一類(lèi)蛋白質(zhì)， SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。 ? 13. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異常或結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測(cè)相對(duì)分子量。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例 （即： SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則 SDS結(jié)合量不足。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間需更長(zhǎng)，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對(duì)孔徑大小要求不高，因此不必等很長(zhǎng)時(shí)間 (完全聚合需 8 h)。 SDS加入后不會(huì)對(duì)凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會(huì)使凝膠孔徑變小，這一特性可用來(lái)分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。通常在較好的真空度脫氣至少 15 min 。 7. 氧氣的影響 氧氣會(huì)與被激活的單體自由基作用抑制聚合過(guò)程，因此需在加激活劑前對(duì)單體溶液脫氣。 6. 溫度的影響 聚膠的最佳溫度為 23~25 ℃ ，需要注意灌膠前單體溶液 (通常置于 4℃ 冰箱 )及玻璃板或管 (有時(shí)從烘箱取出 )也要平衡至此溫度。增加過(guò)硫酸銨或 TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長(zhǎng)度縮短，凝膠會(huì)變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。另外在配制凝膠溶液時(shí)過(guò)硫酸銨不易過(guò)量，否則會(huì)使蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中被氧化 (主要指天然無(wú)變性劑凝膠 )。保存固體過(guò)硫酸銨應(yīng)密閉
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