雙向凝膠電泳ppt課件(參考版)
2025-05-15 06:39本頁面
【正文】 使用 IAA平衡 IPG膠條，去除額外的 DTT 成對的豎直條紋遍布于膠上； 可能是有硫脲引起的，原因尚不明 Thanks ! 。 溴酚藍(lán)前沿不規(guī)則 受 IPG buffer影響，對最終的結(jié)果沒有影響； 膠條太舊或二向成品膠太舊，檢查日期是否過期； IPG膠條轉(zhuǎn)移到二向時(shí)下面有氣泡； 保證膠條和二向膠頂部緊密接觸，無氣泡。 溴酚藍(lán)前沿一邊上翹 陰極電泳緩沖液沒有接觸膠的一端； 保證電泳緩沖液覆蓋了膠的全長。 2DPAGE問題與原因 第二向 SDSPAGE（垂直系統(tǒng)）的問題 問題與現(xiàn)象 可能原因與解決措施 開始時(shí)沒有電流 上下槽是否有電泳緩沖液。 電流為零或很低 持膠槽和電極接觸不好，或者電極和膠條的接觸不好； 檢查以上接觸情況，檢查膠條是否重泡漲。A； IPG膠條沒有完全重泡漲； 應(yīng)檢查重泡漲液的體積，保證重泡漲液的體積足夠； IPG膠條過于干燥；重泡漲和等電聚焦時(shí)加礦物油。 凝膠的圖像處理和分析 典型流程： ? 凝膠圖像的掃描； ? 圖像加工； ? 斑點(diǎn)檢測和定量； ? 凝膠配比； ? 數(shù)據(jù)分析； ? 數(shù)據(jù)呈遞和解釋； ? 2DE數(shù)據(jù)庫的建立。它們不包含戊二醛、甲醛或 Tween20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái) (包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等 ) 相結(jié)合。 ? 在 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或 Edman測序來鑒定蛋白質(zhì)。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為 3個(gè)數(shù)量級。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的 SYPRO Red、Orange、 Ruby等熒光染料。 ? 這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。 膠體擴(kuò)散染料 ? 主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和 PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。 ? 它主要適用于蛋白質(zhì)顯色 、 完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 。 ? 結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明 。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 ? 胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和 /或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。 有機(jī)染料和銀染 ? 考染靈敏度為 30~100ng，線性范圍是 20倍；銀染的線性范圍是 40倍，靈敏度是考染的 100倍。 ? 電泳過程中溫度一般控制在 1015℃ 。常用的是 12%和 %的均一膠，灌膠方便，重復(fù)性好，但相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較為聚集，分離不佳。相比較之下，氣泡對圖譜的影響較小，故常推薦第一種方式。 ? IPG膠條轉(zhuǎn)移到 SDSPAGE有兩種方式：一種方式是先將 IPG膠條放到 SDSPAGE膠上，再加入熔化的瓊脂糖溶液；另一種方式是先加入熔化的瓊脂糖溶液，再將 IPG 膠條放到 SDSPAGE 膠 上。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，可以把 IPG 膠條看作是壓縮膠，因?yàn)樵? IPG 膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF 膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠，所以只需使用分離膠（也可使用壓縮膠）。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 ? 但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE 時(shí)電泳能順利進(jìn)行。 IEF的基本條件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 兩維間的平衡 ? 一維（等點(diǎn)聚焦）電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－ 80176。 ? 等電聚焦的電壓上升分為三個(gè)階段首先加上一個(gè)比較低的電壓，去出膠條中的過多的鹽離子；然后開始加高電壓，電壓上升的模式為緩慢上升；最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。 ? 過度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 ? 從理論上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需的最佳時(shí)間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。 聚焦時(shí)間的優(yōu)化 ? 重泡漲結(jié)束后，在膠條和電極之間加上潤濕的小紙片，它可以吸收鹽離子和補(bǔ)充水分。 ? 重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)行，此時(shí)樣品已經(jīng)加到重泡漲液中，在加樣杯上樣 (cup loading) 方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電
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