雙向凝膠電泳ppt課件(2)(參考版)
2025-05-06 18:46本頁面
【正文】 2DPAGE的高通量與自動化 Twodimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains— T. Rabilloud (Proteomics 2022, 2, 310) 2D Gel Databases ? Biobase 角質(zhì)形成細(xì)胞 ,膀胱癌等 (丹麥 Center for Genome Research) ? ECO2DBASE 大腸桿菌 (在 NCBI庫中 ) ? Heart2DPAGE 人心肌 (德國柏林 ) ? HSC2DPAGE 人類心臟 (英國 Harefield, Heart Science Center) ? LSB 人類 ,小鼠和大鼠肝臟等 (美國 Large Scale Biology) ? QUESTRef52 細(xì)胞 ,大鼠胚胎 ,酵母 (美國 Cold Spring Harbor Lab) ? SWISS2DPAGE 十個人類圖譜 ,包括 : 肝 , 漿細(xì)胞 , 紅細(xì)胞 , 血小板 , 以及酵母 , 大腸桿菌 (瑞士日內(nèi)瓦 , University Hospital) ? Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典 Goteb University) ? Yeast S. cerevisiae (美國 Proteome Inc.) 雙向電泳分離技術(shù)的網(wǎng)路資源 國家生物醫(yī)學(xué)分析中心蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)（ NCBA）： 丁香園論壇： Biorad公司 ,BioRad Laboratories 中國生命科學(xué)論壇： 。 ?利用 IPGphor II進(jìn)行第一向分離和 Ettan DALT垂直電泳儀進(jìn)行第二向分離，在一塊 2D膠上同時分離多達(dá)3個樣品。由于實驗方法本身造成的蛋白質(zhì)斑點強(qiáng)度的差異 ,比如樣品在進(jìn)入膠條時會有一些樣品損失 ,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會出現(xiàn)這樣的差異。 ?該方法的靈敏度可與銀染和 SYPRO Ruby 相媲美，可以檢測到100～ 200pg 的蛋白質(zhì) ,線形動態(tài)范圍在 5個數(shù)量級左右。 ?所得到的 2D 膠圖像可使用 3 種不同的激發(fā) P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號 ,根據(jù)這些信號的比例來判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異 ,這樣可避免在匹配時出現(xiàn)的誤差 ,進(jìn)行定量分析時也不依賴于膠與膠之間的重復(fù)性。固定化 pH梯度膠已有商品生產(chǎn)，基本解決了重復(fù)性的問題； 2DPAGE的靈敏度 ?SDSPAGE有垂直板和水平超薄膠電泳兩種方法，可分離 10～ 100kD分子量的蛋白質(zhì)； ?銀染色法可檢測到 4ng蛋白，同位素標(biāo)記法最靈敏，可測定 20ppm的標(biāo)記蛋白。 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS＋ 5%βME＋ 95℃ 變性 5min，IEF在 8M尿素＋ 1%NP40條件下進(jìn)行 ， 之后膠條用 2%SDS＋5%βME平衡 ， 然后進(jìn)行 SDSPAGE。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦 ， 之后用 8M尿素＋ 5%βME＋ 2%SDS進(jìn)行平衡 ， 再進(jìn)行第二向 SDSPAG電泳 。 C for 1624 hours EXTRACT ? Soak slices 50% acetonitrile with 5% TFA ? Transfer supernatant to new plate or tube ? Extract slices again and bine supernatants DRY ? Speedvac or lyophilize bined supernatants to plete dryness ? Reconstitute dried samples in 50% acetonitrile with % TFA RECONSTITUTE ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行 ， 這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF， 之后在 2%SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行 。 C – preferably onetimeuse aliquots of ~100 181。 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 金屬螯合染料 ? 這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的 、 相對較新的蛋白質(zhì)顯色試劑 ， 其設(shè)計專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容 。 ? 最好的膠體金染色的靈敏度與 PAGE膠內(nèi)的銀染類似。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 ? 速度快 （ 5~15min
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