雙向凝膠電泳ppt課件(2)-wenkub.com
2025-04-30 18:46 本頁(yè)面
【正文】 大大減少了一個(gè)實(shí)驗(yàn)需要的膠的總數(shù)。 Fluorescence 2D differential gel electrophoresis (F2D DIGE) 利用雙熒光標(biāo)記在同一塊膠上進(jìn)行兩組樣品的差異性比較 優(yōu)點(diǎn) ?該方法提高了定量上的準(zhǔn)確性。 2DE的局限性 ? 低豐度蛋白、膜蛋白、堿性蛋白的分離與檢測(cè) ? 重復(fù)性 ? 規(guī)?；c自動(dòng)化 Strategies for increasing resolution ?Using large amount of samples ?To remove abundant proteins ?Using wide pH gradient immobilized gel strips (pH310) ?To try narrow pH gradient gel strips 預(yù)分步收集 細(xì)胞漿 細(xì)胞核 細(xì)胞膜 核糖體及其他特定細(xì)胞成份 細(xì)胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 3倍 3倍 熒光差異雙向電泳 (DIGE) 技術(shù)路線 ?是將樣品在電泳前標(biāo)記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料（其中Cy2 作為用 Cy Cy5 標(biāo)記的蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)） ?將標(biāo)記后的 3 種樣品混合 , 同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳。 此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取 、 蛋白酶消化 、MALDITOFMS分析鑒定 ， 提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息 。l ? Rehydrate slices with trypsin solution – incubate while securely covered at 37176。 它們不包含戊二醛 、甲醛或 Tween20等 ， 很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái) （ 包括自動(dòng)化凝膠染色儀 、 圖像分析工作站 、 機(jī)器人剪切儀器 、 蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等 ） 相結(jié)合 。 膠體擴(kuò)散染料 ? 主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和 PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。 ? 結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明 。 ? 這三種染料可對(duì) SDSPAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色 ， 約 30~60min完成 ， 靈敏度為 2~10ng。 ? 銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 保存數(shù)月。 ? 聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。通過(guò)這種方式生成的 IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 ?極端分子量的蛋白質(zhì)：小于 8kD和大于 200kD的蛋白在常規(guī) IPG2D上不易看到，這可能是在 Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的 dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量 ， 但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷 ， 且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離 。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同 pH范圍的 IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的 pH值與之相符合。 起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于 PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。常用的表面活性劑有離子去污劑 SDS、非離子去污劑Triton X100和 NP兩性離子去污劑 CHAPS、OBG等。 ? 溶解的目標(biāo)： 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使 2DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）； 溶解方法必須允許可能干擾 2DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； 溶解方法要保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。 雙向電泳分析中的樣品制備 制備原則 ： ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制
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