sds聚丙烯酰胺凝膠電泳-wenkub.com
2025-05-06 13:13 本頁(yè)面
【正文】 我們還用基因表達(dá)芯片分析了這兩個(gè)基因下調(diào)后其他基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)鋅指蛋白發(fā)生了明顯的變化。l液體），室溫下孵育 2h； ? 用 PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次 5min，再用 PBS漂洗一次， 5min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。l 共 25181。 梳子需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡 ,梳底需水平。l TEMED 5 181。 3. 按照下表配制 12％分離膠與 4％濃縮膠； 4. 樣品的制備：樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別與 5倍上樣緩沖液按 5： 1的比例混勻，并在 100度沸水浴中煮 5min，取出待用； SDSPAGE凝膠的制作 分離膠 (12%) 濃縮膠 (4%) 超純水 ml 3 ml 30% Acr/Bis 4 ml Buffer 10% SDS 100 181。 ? NGAL的 mRNA信息在 NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中有來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室登記的多個(gè)版本，包含完整編碼區(qū)的有 BC033089和 NM_005564等，編碼區(qū)長(zhǎng)為 597 bp，編碼 198個(gè)氨基酸，包含了 N端前部長(zhǎng)為 20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列（為核酸序列的 160 bp）。 蛋白質(zhì)印跡（ western blotting）的概念 ? 將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 /PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢測(cè)蛋白的一抗（針對(duì)待測(cè)分子的單克隆抗體或多克隆抗體）進(jìn)行反應(yīng)； ? 洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后，加入二抗（針對(duì)一抗的抗體，標(biāo)記有放射性同位素或生物素）； ? 反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過(guò)條帶的密度大小來(lái)進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 ? 電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過(guò)蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。 不連續(xù)系統(tǒng)的特點(diǎn) 濃縮膠的作用 ? 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。 ? 濃縮膠是由 AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為 TrisHC1。 有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)?SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。 ? SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，使蛋白復(fù)合物分解成多個(gè)亞基。 SDSPAGE的原理 SDS的分子式 ? SDS是一種陰離子去垢劑， SO32帶負(fù)電荷。 電泳的概念和分類 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺 (acrylamide， 簡(jiǎn)稱 Acr)和交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺(N,Nmethylenebisacylamide ， 簡(jiǎn)稱 Bis)在加速劑 N,N,N?,N? 四甲基乙二胺 (N,N,N?,N?tetramethyl ethylenedia mine， 簡(jiǎn)稱 TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨 (ammonium persulfate (NH4)2S2O8， 簡(jiǎn)稱 AP)或核黃素 (ribofavin即 vita min B2， C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 ， 以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 簡(jiǎn)稱 PAGE)。 用該軟件來(lái)預(yù)測(cè) NGAL在畢赤酵母高效表達(dá)的概率 ? 截取 NGAL cDNA 3‘末端最后 100bp堿基（包括終止密碼子 TGA），與 pPIC9載體 EcoR I位點(diǎn)后 100bp堿基（包括 EcoR I位點(diǎn)）組成 200bp的序列片段， ? 用 RNAfold軟件計(jì)算 [18,123], [31,140], [35,150], [90,118], [90,151]和 [95,135] 六個(gè)區(qū)間的最低自由能（ RNAfold的溫度參數(shù)設(shè)為 30℃ ）。 ? 我們將 40例數(shù)據(jù)按 75％的比例隨機(jī)分成兩組，多數(shù)組應(yīng)用上述 6個(gè)區(qū)間來(lái)建立
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