sds聚丙烯酰胺凝膠電泳(文件)
【正文】 沖液的 pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類： ? 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。 ? 分離膠是由 AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 TrisHC1。 ? 當(dāng)樣品液和濃縮膠選 Tris/HCL緩沖液，電級液選 Tris/甘氨酸。 A. 為電泳前 2層凝膠排列順序， 2層膠中均有快離子，慢離子 B. 顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。 蛋白印跡基本步驟 1. 固體相上的蛋白質(zhì) 2. 針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗 3. 帶上辣根過氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗 4. 加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光 垂直電泳系統(tǒng) 蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng) 陽極 陰極 濾紙 凝膠 膜 多孔墊片 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置 ? NGAL（ neutrophil gelatinaseassociated lipocalin）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（ lipocalin) 家族的一個(gè)成員。 NGAL基因的簡介 NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列： ? 由 N 端的 310螺旋、 C 端的 α螺旋和中間的八段反平行式 β折疊構(gòu)成了一個(gè) β折疊桶結(jié)構(gòu)； ? 在 β折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個(gè)疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)； ? NGAL 在其 β折疊桶封閉端的 β4β5 環(huán)上有游離的巰基 (C87)，這可使 NGAL 與一些蛋白質(zhì)分子，如 MMP9，形成分子間二硫鍵，并以此來調(diào)節(jié)這些蛋白的功能或活性。l 50 181。l 5 181。 7. 拔出樣梳后 ,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液； 8. 上樣： ? marker 5 181。l ? 上樣時(shí)要記清上樣的順序 ? 微量注射器不可過低 ,以防刺破膠體；也不可過高 , 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔 10. 接通電源， 100V恒壓電泳，至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約 ～ 1cm時(shí)，約 ，停止電泳 ； 11. 凝膠的處理： ? 剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，剝膠時(shí)要小心 ,保持分離膠完好無損 ,將分離膠做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色約 4h；染色后的凝膠板用脫色液脫色 ，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 預(yù)期 SDSPAGE結(jié)果： 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后脫色 Marker 樣品 預(yù)期蛋白印跡結(jié)果 由畢赤酵母表達(dá)的NGAL蛋白 分子量 25K Da 由大腸桿菌表達(dá)的 NGAL蛋白分子量 21KD a 第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河卯叧嘟湍副磉_(dá)以下目的基因，如 Fascin， Ezrin，鋅指蛋白（見下頁）； 2. 預(yù)測這些基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率； 3. 如果這些基因被預(yù)測為低表達(dá)，該如何處理； 4. 由于生成的重組蛋白要求切除信號肽，在選擇多克隆位點(diǎn)和設(shè)計(jì) PCR引物時(shí)應(yīng)注意什么問題； 5. 檢驗(yàn)載體與酵母染色體的不同重組對外源蛋白表達(dá)量的影響； 6. 檢驗(yàn)不同培養(yǎng)條件對外源蛋白表達(dá)量的影響 。 PRDM1 JMJD2B ZC3HAV1 EDD KLF9 ZCHC7 FBXL11 ZDHHC18 ZNF513 MARH6 ZNF92 ZNF555 NR1D2 ZNF277 ZNF638 FUS ZNF292 ZNF740 SHPRH ZNF312 ZNF597 S2A4R ZNF395 ZNF610 TNAP3 ZNF505 ZNF642 WHSC1 ZNF553 ZNF652 NU153 NR4A2 Centauringamma2 。 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組運(yùn)用 RNAi技術(shù)分別下調(diào) Fascin和 Ezrin基因在食管癌細(xì)胞中的表達(dá) ，可顯著降低食管癌細(xì)胞的分裂增殖與侵襲移動(dòng) ，說明這兩個(gè)基因是新的食管癌相關(guān)基因，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著十分重要的角色。l液體）加到保鮮膜上； ? 從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，
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