雙向凝膠電泳ppt課件(2)-資料下載頁
2025-05-03 18:46本頁面
【正文】 GE有垂直板和水平超薄膠電泳兩種方法，可分離 10～ 100kD分子量的蛋白質(zhì)； ?銀染色法可檢測到 4ng蛋白，同位素標(biāo)記法最靈敏，可測定 20ppm的標(biāo)記蛋白。 2DE的局限性 ? 低豐度蛋白、膜蛋白、堿性蛋白的分離與檢測 ? 重復(fù)性 ? 規(guī)模化與自動(dòng)化 Strategies for increasing resolution ?Using large amount of samples ?To remove abundant proteins ?Using wide pH gradient immobilized gel strips (pH310) ?To try narrow pH gradient gel strips 預(yù)分步收集 細(xì)胞漿 細(xì)胞核 細(xì)胞膜 核糖體及其他特定細(xì)胞成份 細(xì)胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 3倍 3倍 熒光差異雙向電泳 (DIGE) 技術(shù)路線 ?是將樣品在電泳前標(biāo)記 Cy Cy3 和 Cy5 這 3 種熒光染料（其中Cy2 作為用 Cy Cy5 標(biāo)記的蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)） ?將標(biāo)記后的 3 種樣品混合 , 同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行電泳。 ?所得到的 2D 膠圖像可使用 3 種不同的激發(fā) P發(fā)射過濾器得到不同顏色熒光信號 ,根據(jù)這些信號的比例來判斷樣品之間蛋白質(zhì)的差異 ,這樣可避免在匹配時(shí)出現(xiàn)的誤差 ,進(jìn)行定量分析時(shí)也不依賴于膠與膠之間的重復(fù)性。 ?用于標(biāo)記的熒光基團(tuán)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似 ,分子量也基本相同 ,都帶有正電荷 ,所以在與賴氨酸殘基反應(yīng)時(shí) ,保證了所有的樣品可以移至相同的位置。 ?該方法的靈敏度可與銀染和 SYPRO Ruby 相媲美，可以檢測到100～ 200pg 的蛋白質(zhì) ,線形動(dòng)態(tài)范圍在 5個(gè)數(shù)量級左右。 Fluorescence 2D differential gel electrophoresis (F2D DIGE) 利用雙熒光標(biāo)記在同一塊膠上進(jìn)行兩組樣品的差異性比較 優(yōu)點(diǎn) ?該方法提高了定量上的準(zhǔn)確性。由于實(shí)驗(yàn)方法本身造成的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度的差異 ,比如樣品在進(jìn)入膠條時(shí)會有一些樣品損失 ,但在同一塊差異凝膠電泳膠上就不會出現(xiàn)這樣的差異。 ?不同的 CyDye（ Cy2, Cy3, Cy5）標(biāo)記的樣品可以在同一塊膠上共分離，保證所有樣品在完全相同的第一向和第二向電泳條件下分離，消除實(shí)驗(yàn)的偏差并保證精確的膠內(nèi)匹配。 ?利用 IPGphor II進(jìn)行第一向分離和 Ettan DALT垂直電泳儀進(jìn)行第二向分離，在一塊 2D膠上同時(shí)分離多達(dá)3個(gè)樣品。大大減少了一個(gè)實(shí)驗(yàn)需要的膠的總數(shù)。 2DPAGE的高通量與自動(dòng)化 Twodimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains— T. Rabilloud (Proteomics 2022, 2, 310) 2D Gel Databases ? Biobase 角質(zhì)形成細(xì)胞 ,膀胱癌等 (丹麥 Center for Genome Research) ? ECO2DBASE 大腸桿菌 (在 NCBI庫中 ) ? Heart2DPAGE 人心肌 (德國柏林 ) ? HSC2DPAGE 人類心臟 (英國 Harefield, Heart Science Center) ? LSB 人類 ,小鼠和大鼠肝臟等 (美國 Large Scale Biology) ? QUESTRef52 細(xì)胞 ,大鼠胚胎 ,酵母 (美國 Cold Spring Harbor Lab) ? SWISS2DPAGE 十個(gè)人類圖譜 ,包括 : 肝 , 漿細(xì)胞 , 紅細(xì)胞 , 血小板 , 以及酵母 , 大腸桿菌 (瑞士日內(nèi)瓦 , University Hospital) ? Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典 Goteb University) ? Yeast S. cerevisiae (美國 Proteome Inc.) 雙向電泳分離技術(shù)的網(wǎng)路資源 國家生物醫(yī)學(xué)分析中心蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)（ NCBA）： 丁香園論壇： Biorad公司 ,BioRad Laboratories 中國生命科學(xué)論壇：
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