sds聚丙烯酰胺凝膠電泳-資料下載頁(yè)
2025-05-10 13:13本頁(yè)面
【正文】 er 5181。l 共 25181。l ? 上樣時(shí)要記清上樣的順序 ? 微量注射器不可過(guò)低 ,以防刺破膠體；也不可過(guò)高 , 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔 10. 接通電源， 100V恒壓電泳，至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約 ～ 1cm時(shí)，約 ，停止電泳 ； 11. 凝膠的處理： ? 剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，剝膠時(shí)要小心 ,保持分離膠完好無(wú)損 ,將分離膠做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色約 4h；染色后的凝膠板用脫色液脫色 ，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 ? 蛋白質(zhì)印跡操作 ? 將 PVDF膜先置于 100%甲醇中浸濕 15s，然后移至超純水中浸泡 2min，最后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中至少平衡 5min； ? 電泳完畢的凝膠，剝落到轉(zhuǎn)移液中平衡 30min，將轉(zhuǎn)印用的濾紙和海綿墊均用轉(zhuǎn)移液浸濕； ? 將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒搟走里面的氣泡，在墊子上墊 2張 10 10 cm的濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡； ? 從轉(zhuǎn)移液中取出平衡好的分離膠蓋于濾紙上，用玻棒搟去氣泡，將平衡好的PVDF膜蓋于膠上，并去除氣泡； ? 在膜上蓋 2張 cm的濾紙并除去氣泡，最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子； ? 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中， 60V轉(zhuǎn)移 2h，將膜用超純水漂洗一下，室溫晾干 ； 蛋白質(zhì)印跡操作步驟 蛋白印跡系統(tǒng) 免疫檢測(cè)的操作 ? 將膜用 100％甲醇浸濕 5min，再用超純水漂洗一下，移至含有 50ml封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉 1h； ? 將一抗（大鼠抗人 NGAL單克隆抗體）用封閉液 1： 200稀釋；鋪保鮮膜于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，將抗體溶液（每張膜 500181。l液體）加到保鮮膜上； ? 從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育 2h； ? 用 PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次 5min，再用 PBS漂洗一次， 5min； ? 二抗（山羊抗大鼠 IgG HRP）用封閉液 1： 2021稀釋并與膜蛋白面接觸（每張膜 500181。l液體），室溫下孵育 2h； ? 用 PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次 5min，再用 PBS漂洗一次， 5min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 預(yù)期 SDSPAGE結(jié)果： 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后脫色 Marker 樣品 預(yù)期蛋白印跡結(jié)果 由畢赤酵母表達(dá)的NGAL蛋白 分子量 25K Da 由大腸桿菌表達(dá)的 NGAL蛋白分子量 21KD a 第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河卯叧嘟湍副磉_(dá)以下目的基因，如 Fascin， Ezrin，鋅指蛋白（見下頁(yè)）； 2. 預(yù)測(cè)這些基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率； 3. 如果這些基因被預(yù)測(cè)為低表達(dá)，該如何處理； 4. 由于生成的重組蛋白要求切除信號(hào)肽，在選擇多克隆位點(diǎn)和設(shè)計(jì) PCR引物時(shí)應(yīng)注意什么問(wèn)題； 5. 檢驗(yàn)載體與酵母染色體的不同重組對(duì)外源蛋白表達(dá)量的影響； 6. 檢驗(yàn)不同培養(yǎng)條件對(duì)外源蛋白表達(dá)量的影響 。 7. 請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)一“蛋白質(zhì)各種定量方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較”，選擇適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)外源基因在酵母中的表達(dá)量，并說(shuō)明理由。 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組運(yùn)用 RNAi技術(shù)分別下調(diào) Fascin和 Ezrin基因在食管癌細(xì)胞中的表達(dá) ，可顯著降低食管癌細(xì)胞的分裂增殖與侵襲移動(dòng) ，說(shuō)明這兩個(gè)基因是新的食管癌相關(guān)基因，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著十分重要的角色。我們還用基因表達(dá)芯片分析了這兩個(gè)基因下調(diào)后其他基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)鋅指蛋白發(fā)生了明顯的變化。 PRDM1 JMJD2B ZC3HAV1 EDD KLF9 ZCHC7 FBXL11 ZDHHC18 ZNF513 MARH6 ZNF92 ZNF555 NR1D2 ZNF277 ZNF638 FUS ZNF292 ZNF740 SHPRH ZNF312 ZNF597 S2A4R ZNF395 ZNF610 TNAP3 ZNF505 ZNF642 WHSC1 ZNF553 ZNF652 NU153 NR4A2 Centauringamma2
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