sds聚丙烯酰胺凝膠電泳-展示頁
2025-05-22 13:13本頁面
【正文】 aluation”按鈕，在“ Evaluation”方框中顯示預(yù)測的結(jié)果； 3. 如果結(jié)果顯示低于 ，則可點(diǎn)擊“ Design”這個(gè)按鈕，則顯示根據(jù)密碼子使用改造后的序列。 ? 對于每個(gè)新數(shù)據(jù)，為了預(yù)測該基因是否能在酵母中高效表達(dá)（表達(dá)水平大于 100 mg/L），可先計(jì)算這 6個(gè)區(qū)間的最低自由能，然后運(yùn)算上述的 1,000個(gè)判別函數(shù)，來評估該基因高效表達(dá)的概率。 ? 使用 Tclass程序?qū)ψ畹妥杂赡芫仃囘M(jìn)行 t檢驗(yàn)及判別分析，得到理論上可以判別表達(dá)水平高低的 6個(gè)區(qū)間組合。 ? 從上述每個(gè)基因的 200bp片段，截取 9,000個(gè)區(qū)間，截取方式為 [X, Y], X和 Y在 200bp片段的范圍為 1≤X≤100, 和 111≤Y≤200。擬定以表達(dá)量 100 mg/L為界限，將 40例目的基因表達(dá)水平分為高 /低兩組。末端的最低自由能穩(wěn)定性對于實(shí)現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達(dá)是比較重要的因素，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授課題組建立了一個(gè)針對 pPIC9表達(dá)載體在畢赤酵母中高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu) pPIC9載體的信號肽序列和多克隆位點(diǎn) 1. 載體的 339。AOX1 啟動子片段含有 AOX1啟動子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動外源蛋白的表達(dá)； ? α因子信號肽序列為約 89個(gè)氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化； ? 多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)； ? TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和 polyA修飾信號； ? HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志； ? 339。 ? 由畢赤酵母表達(dá)應(yīng)用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)、腫瘤壞死因子 (TNF)、表皮生長因子 (EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。 ? 幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母 (pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生長力以及其它一些獨(dú)特的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。? 外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測 ? 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定 ? 分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率 綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 2 1. 第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測 2. 第二部分：畢赤酵母蛋白表達(dá)產(chǎn)物的 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定 3. 第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率 此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分 ? 在科研和臨床中需要大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白不可能由人體組織或體外細(xì)胞培養(yǎng)而大規(guī)模的獲得，人們利用一些低等生物的特點(diǎn)，來生成和獲得這些人屬蛋白質(zhì)。 ? 酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的合適宿主。畢赤酵母以甲醇為營養(yǎng)來源。 第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測 微觀的酵母細(xì)胞 ? 539。 AOX1 基因片段能夠與基因組 AOX1基因?qū)偻粗亟M； ? 抗 Amp 基因和 pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在 。 AOX1區(qū)與基因組的AOX1基因的末端發(fā)生整合重組 表達(dá)載體與畢赤酵母基因組發(fā)生重組的兩種方式： 2. 載體的 HIS4區(qū)與基因組的 HIS4基因的末端發(fā)生整合重組 甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素 ? 載體穩(wěn)定性：是整合還是粘附到酵母染色體上 ? 基因劑量：單 /多拷貝 ? 甲醇利用表型： Muts(利用甲醇慢型 )， Mut+ (利用甲醇快型 ) ? mRNA5′端：應(yīng)盡量避免在 UTR區(qū)出現(xiàn) AUG和次級結(jié)構(gòu) ? AT含量： AT含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的結(jié)構(gòu) ? 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性：分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響因素 外源基因的 339。 模型構(gòu)建原理 ? 收集 40例應(yīng)用 pPIC9載體在畢赤酵母 GS115株中表達(dá)目的基因的數(shù)據(jù)。 ? 確認(rèn)表達(dá)載體的翻譯終止密碼子前后各 100bp的序列，據(jù)此對每個(gè)數(shù)據(jù)構(gòu)建 200bp的片段。 ? 使用 RNAfold軟件對每個(gè)區(qū)間計(jì)算最低自
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